Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

Переход через все фазы клеточного цикла связан с плотно регулируемой программой экспрессии генов. Считается, что это скоординированное «включение и выключение» транскрипции генов в течение клеточного цикла находится под контролем сложных регуляторных систем транскрипции, регулирующих не только время, но также и уровни экспрессии генов. Известно, что дерегулирование компонентов ключевого клеточного цикла способствует развитию нескольких заболеваний и является хорошо зарекомендовавшим себя признаком опухолевого генеза ^{1 , 2} . Проведенные в клетках дрожжей и млекопитающих широкомасштабные транскриптомические анализы показали, что большое количество генов проявляют периодические образцы экспрессии генов в клеточном цикле, что указывает на то, что флуктуация транскрипции во время клеточного цикла является отражением временного требования к данному продукту гена В точной фазе ^{3 , 4 ,} </suP> ⁵ .

Основная задача изучения экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, – это синхронизация клеток на фазах конкретного клеточного цикла. Синхронизация клеток помогает интерпретировать ассоциацию шаблона экспрессии генов с конкретным фазовым переходом на клеточный цикл, и это привело к лучшему пониманию регуляции и функции многочисленных генов. Синхронизация клеток также важна для изучения механизма действия противораковых лекарств, поскольку известно, что химиотерапевтические агенты влияют как на экспрессию генов, так и на кинетику клеточного цикла ^{6 , 7} . Тем не менее, часто бывает трудно определить, являются ли различия в экспрессии генов, возникающие в результате лечения этими агентами, прямым ответом на лечение или являются просто следствием изменений в профилях клеточного цикла. Чтобы различать эти возможности, экспрессию генов следует анализировать в клетках, которые былиСинхронизируется до добавления химиотерапевтического препарата.

За исключением некоторых первичных клеток, таких как недавно выделенные лимфоидные клетки, которые представляют собой гомогенную популяцию клеток, синхронизированную в G0 ⁸ , in vitro установленные клеточные линии асинхронно растут в культуре. При регулярных условиях роста эти асинхронно циклические клетки находятся во всех фазах клеточного цикла, но предпочтительно в G1 ⁹ . Следовательно, этот контекст не обеспечивает оптимальный сценарий для анализа функциональных или генных экспрессии в конкретной фазе клеточного цикла ( например, G1, S и т. Д.). Не трансформированные иммортализованные клеточные линии ( например, фибробласты) могут быть синхронизированы с так называемыми физиологическими методами ¹⁰ . Эти методы основаны на сохраненных первичных клеточных характеристиках нетрансформированных клеток, таких как ингибирование клеточного контакта и зависимости фактора роста, чтобы продолжить циклирование. УдалениеСыворотки в сочетании с контактным торможением делает нерепрессированные клетки, арестованные в G0 / G1. Однако синхронизированный вход и прогрессирование циклического цикла часто требует субкультуры, которая также включает в себя искусственное отслоение клеток и повторное покрытие ¹⁰ . Самое главное, этот метод не подходит для синхронизации трансформированных клеточных линий, подавляющее большинство установленных клеточных линий, которые в настоящее время используются, характеризуется отсутствием клеточного опосредованного клеточным ингибированием роста или ответа на вывод фактора роста. Таким образом, ясно, что для эффективной синхронизации соты в конкретных фазах клеточного цикла требуются альтернативные методы. В общих чертах наиболее часто используемые методы синхронизации основаны на временном химическом или фармакологическом ингибировании одной определенной точки клеточного цикла, как правило, синтезе ДНК или образовании митотического веретена. Ингибирование синтеза ДНК синхронизирует клетки, останавливая их в поздней фазе G1 или ранней S. Это может быть achiПутем добавления таких соединений, как мимозин, ингибитора биосинтеза нуклеотидов ^{11 , 12} , афидиколина, ингибитора ДНК-полимераз ^{13 , 14} , гидроксимочевины, ингибитора рибонуклеотидредуктазы ^{15 , 16} или избыточных количеств тимидина ^{17 , 18} . С другой стороны, ингибиторы полимеризации микротрубочек, такие как колхицин или нокодазол, способны блокировать образование митотического веретена, приводя к синхронизации клеток на ранней фазе M ^{19 , 20 , 21} .

В этой работе мы описываем метод, включающий два дополнительных протокола синхронизации, основанных на переходном химическом ингибировании для изучения экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, в мРНКуровень. Этот метод является фундаментальным для определения роли генов клеточного цикла в конкретных процессах клеточного цикла. Кроме того, он обеспечивает общую структуру для изучения влияния противоопухолевых обработок, чтобы точно определить гены, чувствительные к лекарственным средствам, и свести к минимуму неверные истолкования, вызванные нарушениями в прогрессировании клеточного цикла, вызванными этими препаратами.