Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung
Summary
Peptid-Konkurrenz-Assays sind weit verbreitet in einer Vielzahl von molekularen und immunologischen Experimenten verwendet. Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode für einen in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay und die damit verbundenen Validierungsverfahren, die nützlich sein können, um spezifische Phosphorylierungsstellen zu finden.
Abstract
Die Proteinphosphorylierung an bestimmten Stellen bestimmt ihre Konformation und Interaktion mit anderen Molekülen. So beeinflusst die Proteinphosphorylierung biologische Funktionen und Eigenschaften der Zelle. Derzeit ist die häufigste Methode zur Entdeckung von Phosphorylierungsstellen durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie (LC / MS) -Analyse, ein schnelles und empfindliches Verfahren. Allerdings werden relativ labilile Phosphatreste oft aus Phosphopeptiden während des Fragmentierungsschrittes freigesetzt, was oft falsch-negative Signale ergibt. In solchen Fällen wäre ein herkömmlicher in vitro -Kinase-Assay unter Verwendung von ortsgerichteten Mutanten genauer, aber diese Methode ist mühsam und zeitaufwändig. Daher kann ein alternatives Verfahren unter Verwendung von Peptidwettbewerb vorteilhaft sein. Das Konsensuserkennungsmotiv der 5'-Adenosinmonophosphat-aktivierten Proteinkinase (AMPK) wurde 1 etabliert und wurde unter Verwendung eines Positions-Scanning-Peptid-Bibliotheks-Asss validiertAy 2 Somit könnten AMPK-Phosphorylierungsstellen für ein neuartiges Substrat vorhergesagt und durch die Peptidwettbewerbsassays bestätigt werden. In diesem Bericht beschreiben wir die detaillierten Schritte und Verfahren für den in vitro- Oligopeptid-konkurrierenden Kinase-Assay durch die Veranschaulichung der AMPK-vermittelten Kernfaktor-Erythroid-2-verwandten Faktor 2 (Nrf2) -Phosphorylierung. Um die Phosphorylierungsstelle zu authentifizieren, führten wir einen sequentiellen In-vitro -Kinase-Assay unter Verwendung einer ortsspezifischen Mutante durch. Insgesamt liefert der Peptid-Konkurrenz-Assay ein Verfahren zum Screening mehrerer potentieller Phosphorylierungsstellen und zur Identifizierung von Stellen für die Validierung durch die Phosphorylierungsstellen-Mutanten.
Introduction
Die Proteinphosphorylierung an einem spezifischen Rückstand spielt eine wichtige Rolle in einem breiten Spektrum zellulärer Prozesse. Somit erfordert ein Verständnis von Signalisierungsnetzwerken die Identifizierung spezifischer Phosphorylierungsstellen. Darüber hinaus bestimmt die Phosphorylierungsstelle die Wirkung auf die Proteinfunktion, da einzelne Domänen innerhalb eines Proteins unterschiedliche Strukturen und Funktionen besitzen. Die Aktivität des Kernfaktor-Erythroid-2-Faktors 2 (Nrf2), ein wichtiger Antioxidans-Transkriptionsfaktor, wird durch Phosphorylierung an verschiedenen Stellen bidirektional reguliert. Unsere Studien konzentrierten sich auf die Kinasen, die die Phosphorylierung von Nrf2 katalysieren. Die Stressreaktion von Nrf2 gegen oxidative Herausforderung erfolgt rasch, vor allem durch Phosphorylierung am Serin 40 und vermittelt durch die Proteinkinase C (PKC) -δ, die Nrf2 3 , 4 aktiviert. Umgekehrt katalysiert Fyn die hemmende Phosphorylierung von Nrf2 bei Tyrosin 568 zur engen Kontrolle der Aktivität 5 .
Die häufigste Methode zur Entdeckung von Phosphorylierungsstellen ist die Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie (LC / MS) -Analyse. Auf diese Weise können schnelle und hochempfindliche Phosphorylierungsstellen-Mapping-Daten erzeugt werden. Allerdings hat es mehrere technische Einschränkungen, die oft falsch-negative Signale erzeugen. Schlechte Sequenzabdeckung tritt häufig in der LC / MS-Analyse auf. Um Phosphorylierungsstellen zu identifizieren, sind Informationen über die maximale Aminosäureabdeckung eines Proteins erforderlich 6 . Die Proteolyse des Proteins von Interesse mit mehreren Proteasen während des Verdauungsschrittes kann bei der Verbesserung der Sequenzabdeckung hilfreich sein. Ein weiteres Hindernis für die Identifizierung von Phosphorylierungsrückständen ist der leichte Verlust an Phosphorsäure, der häufig für Serin- und Threonin-phosphorylierte Peptide 6 , 7 beobachtet wird . Labile Phosphatreste sind oftAus Phosphopeptiden während des Fragmentierungsprozesses freigesetzt 7 . Die zweite Option bei der Suche nach Phosphorylierungsstellen ist die Verwendung eines Peptid-Mikroarray-Verfahrens. Es ist möglich, die Kinase-Zielstellen unter Verwendung eines Mikroarray-Chips, der Peptidfragmente enthält, die von einem Protein von Interesse abgeleitet sind, zu screenen. Aufgrund des Ausrüstungsbedarfs für die Herstellung und Detektion eines Mikroarray-Chips wird das Peptid-Mikroarray-Verfahren jedoch als zeitaufwändig und teuer angesehen.
Um diese Herausforderungen zu überwinden, kann ein in vitro- Oligopeptid-konkurrierender Kinase-Assay für eine Proteinkinase mit bekannten Erkennungsmotiven verwendet werden. Wenn das Konsensuserkennungsmotiv einer Kinase festgestellt wird, können mutmaßliche Phosphorylierungsstellen eines Kandidatensubstrats vorhergesagt und die Echtheit der Stellen validiert werden. Die überzeugendste Methode für dieses Verfahren ist, die Aufhebung der Phosphorylierung in einem mutierten Protein zu zeigen, in dem die PrädikatD-Rest wird mit einer nicht phosphorylierbaren Aminosäure ( dh Serin oder Threonin zu Alanin, Tyrosin zu Phenylalanin) substituiert. Allerdings ist die Herstellung und Isolierung von mutierten Proteinen zeitaufwändig. Als Alternative im Anfangsstadium der Forschung ist der kompetitive Peptid-Kinase-Assay einfach und bequem. Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen In-vitro- Peptid-Konkurrenz-Assay und für die Validierung der Phosphorylierungsstelle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als einfacher und bequemer Weg, um die Echtheit der von AMPK vermittelten vorhergesagten Phosphorylierungsstellen zu beurteilen, beschreiben wir hier einen in vitro -Kinase-Assay, der verwendet werden kann, um eine spezifische Phosphorylierungsstelle unter Verwendung von kompetitiven Peptiden zu entdecken und sie mit einer ortsspezifischen Mutante zu verifizieren . Die repräsentativen Daten, die aus dem in vitro- kompetitiven AMPK – Aktivitäts-Assay erhalten wurden, stimmen mit den Ergebniss…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der von der koreanischen Regierung finanzierten National Research Foundation of Korea (MSIP) (Nr. 2015R1A2A1A10052663 und Nr. 2014M1A3A3A02034698) unterstützt.
Materials
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol | Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
