결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법
Summary
노출 된 정상적인 안구 표면은 각막과 결막으로 이루어져 있습니다. 상피 세포, 배 세포 및 면역 세포가 결막에 존재한다. 여기, 노출 세포학의 비 침습적 기술은 인상 세포학 장치 및 결막의 면역 세포를 분석하는 유동 세포 계측법을 사용하여 설명합니다.
Abstract
전통적으로 안구 표면 세포학은 주걱 기술 및 브러시 기술과 같은 기술로 연구됩니다. 이 기술의 문제점은 눈의 표면에 외상성 병변을 유발할 수 있다는 것입니다. 외상성 병변은 흉터, 눈꺼풀의 기형, 윤부 줄기 세포 결핍으로 진행될 수 있으며 경우에 따라 피험자에게 커다란 불편 함을 유발할 수 있습니다. 이러한 임상 적 문제를 피하기 위해 안구 건조증과 신 생물, 아토피 성 질환, 춘추 각 결막염 및 각 결막염을 진단하기위한 인상 세포학 (IC)이 개발되었습니다. 전형적으로, 임상의는 수작업으로 여과지를 필요한 모양으로 자르고이를 안구 표면에 적용합니다. 여기서는 시중에서 판매되는 의료 기기를 사용하여 IC를 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기법은 유동 세포 계측법에 의한 면역 표현형 분석이 뒤 따릅니다. 이 기술은 수동 조작을 덜 필요로하고 안구 표면 손상을 줄입니다.
Introduction
Impression cytology (IC)는 Thatcher et al .에 의해 1977 년에 처음 수행되었다 . 그들은 스크래핑, 스왑 또는 피펫 팅과 같은 그 당시 사용 가능한 다른 기술 대신 환자로부터 결막 세포를 수집하기 위해 플라스틱 인상 디스크를 사용했습니다 1 . IC의 현재 기술은 구와 눈의 결막을 각인시키고 결막 세포의 가장 표면층을 모으기 위해 흡수성 여과지 2 를 사용합니다. 분화의 최종 단계에 도달 한이 세포들은 계속 눈물을 흘립니다 3 . 상피 세포 4 , 상 세포 3 , 5 및 점막 관련 림프 조직 – 상피 – 관련 이펙터 T 세포 또는 수지상 세포 6의 세 가지 주요 개체군이 IC 표본에서 발견됩니다. IC 칩 표면의 안구 세포ples은 현미경 검사, 면역 블 랏팅 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)으로 분석 할 수 있습니다 7 . 유동 세포 계측법은 최근에 IC 멤브레인을 긁어서 수집 한 면역 세포를 분석하는데 사용되었습니다 8 . 흥미롭게도 IC6,9는 점막 각 결막염, 비타민 A 결핍, 간질 성 천포창, 아토피 성 질환, 상연 성 각 결막염, 춘추 각 결막염 및 상피 편평 상피화를 포함한 많은 안구 질환을 평가하는데 사용되어왔다. IC는 또한 콘택트 렌즈 착용, 안구 표면 미생물 검출, 종단 연구 10 , 11 , 12의 치료 효과 및 내성 시험에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었습니다.
의료 기기 (EyePrim)는 일종의 폴리이전에 유동 세포 계측법 (OSIC-flow)으로 안과 인상 세포학 기술에 대해 검증 된 종전 샘플링을 사용하여 질병 진행 및 치료에 대한 반응을 모니터 할 수있는 기회를 열어주는 PES 0.2 μm 멤브레인 점막 유 천포창에서 진행성 결막 섬유증의 추정 질환 마커로 정의 된 상피 세포 백혈구 분석 13) . 초기 연구자들은 수동 인상이 필요한 고압 증기 멸균 된 PES 필터를 사용했습니다. 결과적으로 생산량은 가변적이었고 사용자에 따라 결정되었습니다. 이 의료 기기의 장점은 사용 편의성, 표준화 된 압력 (Pa 또는 N / m 2 )이며 반복성, 재현성 및 일관된 세포 재생을 가능하게합니다. 이 기술은 비 외과 수술이며, 수행하기 쉽고 빠르기 때문에 외래 환자 클리닉에서 유용합니다. 이 지침은 지침 93 / 42 / CEE, CE 0499 (SNCH)에 따라 Class I (무균) 의료 장비입니다. 필요한 것만이는 안구 표면의 무결성 유지를 보장하는 시술 중의 국소 마취이다. IC 이후에, 세포는 유동 세포 계측법을 위해 즉시 처리 될 수 있습니다. 또한, 비 안과 기술자 및 간호사가 안구 표면을 샘플링하도록 훈련받을 수 있습니다.
다른 기술에 비해 IC의 향상에도 불구하고 몇 가지 과제가 남아 있습니다. 예를 들어, IC의 위치에 따라 샘플링 영역 및 구 결막에서 지역적 차이로 인해 변동이있을 수 있습니다. 변동의 또 다른 원인은 IC 동안 다양한 양의 압력을 가하기 때문입니다. 다른 방법 론적 쟁점은 세포 처리 표준화와 관련이있다. 여기에는 지속 기간과 고정 방법, 시료 채취 된 물질의 안정성에 영향을 줄 수있는 저장 조건이 포함된다.
이 기술의 전반적인 목표는 안구 인상 샘플을 고립시키는 방법을 개발하는 것입니다.t는 사용하기 쉽고 비 침습적이며 임상 샘플의 면역 학적 특성 분석에 적용 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이는 스크래핑, 스왑 핑, 피펫 팅 또는 흡착 여과지 1 , 2 와 같은 기존 기술과 비교하여 비교적 빠른 면역 프로파일 링을 위해 외래 진료소에서 사용할 수있는 쉽고 빠르며 덜 침습적 인 기술입니다. 이 기법의 변형은 연구 설정에서 이미 사용되고 있습니다 22 . 향후 제안 된 방법론의 적용은 안구 질환, 특히 면역 표현형을 필요로하는 임상 시험에서 환자 층화에 적용됩니다.
이 기술의 주요 문제점은 인상 채취 및 스크래핑 후에 회수되는 비교적 적은 면역 세포입니다. 개체 당 4 번의 노출에서 회복 된 CD3 + T 세포의 총 수는 ~ 500 ~ 1,000 개의 세포에서 다양합니다. 안구 샘플은 세포의 추가 손실을 피하기 위해 최소 횟수 동안 유세포 분석을하기 전에 세척 하였다에스. 프로토콜 내에 남아있는 중요한 단계와 과제는 높은 세포 수를 달성하기 위해 눈 샘플을 효율적으로 수집하고 멤브레인을 적절히 스크래핑하는 것입니다. 그럼에도 불구하고이 제한은 특정 면역 표현형에 편향되지는 않을 것입니다. 세포 수율을 극대화하기 위해 여기에서 수행 된 문제 해결은 항체 배양 후 및 배양 전 세척 단계 수를 줄이는 것이 었습니다.
IC 사용에는 다른 제한 사항이 있습니다. 스티븐 존슨 (Steven Johnson) 증후군과 같이 심하게 각화되거나 섬유화 된 안구 표면을 가진 환자에서 세포 수율은 본 연구에서보다 낮을 수 있습니다. 같은 날 분석하지 않고 샘플을 보관하면 면역 세포의 비율이 달라질 수 있습니다. 특정 세포 유형이 다른 세포 유형보다 저장에 내성이 있는지를 예측하는 것은 어렵습니다. 이전 연구에서 결막 상피 세포의 HLA-DR 발현이 증가한 것으로보고되었으므로HLA-DR과 특정 면역 세포의 수준 사이의 상관 관계를 평가하기 위해 esting. 면역 세포는 또한 케모카인의 발현 수준과 관련 될 수있다. 이러한 문제는 향후 연구에서 다루어 져야한다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기술 단계를 돕는 Nandini Nallappan 및 Sharon Yeo에게 감사드립니다. 이 연구는 이공천 (Lee Kong Chian) 의대, 남양 공대 (Nanyang Technological University)의 KGC 창업 보조금 및 싱가포르 보건 성 국립 의료 연구위원회 (National Medical Research Council, NMRC)의 고위 임상 의학자 상 (Northern Clinician Scientist Award)의 LT (NMRC / CSA / 045 / 2012), NMRC의 보조금으로 KGC와 LT (NHIC-12D-1409007)에 국가 보건 혁신 센터 (National Health Innovation Center)가 관리한다.
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
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