Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva
Summary
La superficie oculare normale esposta è costituita da cornea e congiuntiva. Le cellule epiteliali, le cellule calde e le cellule immunitarie sono presenti nella congiuntiva. Qui viene descritta una tecnica non invasiva di citologia di impronta usando un dispositivo di citologia di impressione e una citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nella congiuntiva.
Abstract
Tradizionalmente, la citologia di superficie oculare viene studiata con tecniche come la tecnica della spatola e la tecnologia a spazzola. Il problema con queste tecniche è che possono indurre lesioni traumatiche sulla superficie dell'occhio, che possono progredire per la cicatrice, la deformità delle palpebre, la carenza di cellule staminali limbali e in alcuni casi causare grande disagio al soggetto. Per evitare questi problemi clinici, è stata sviluppata la citologia di impronta (IC) per diagnosticare la malattia degli occhi asciutti e successivamente la neoplasia, la malattia atopica, la cheratoconjunctivite vera e la keratoconjunctivitis sicca. Tipicamente i medici tagliano manualmente i filtri nelle forme richieste e applicarle alla superficie oculare. Qui descriviamo come eseguire IC utilizzando un dispositivo medico disponibile in commercio. Qui viene spiegata questa tecnica seguita da immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso. Questa tecnica richiede meno movimentazione manuale e provoca minori lesioni alla superficie oculare.
Introduction
La citologia di impressione (IC) è stata eseguita per la prima volta nel 1977 da Thatcher et al . Hanno usato un disco di impressione in plastica per raccogliere le cellule congiuntivali dai pazienti anziché altre tecniche disponibili in quel momento come raschiatura, svuotamento o pipettatura 1 . La tecnica attuale di IC utilizza una carta filtrante assorbente 2 per imprimere la bulbar e la congiuntiva palpebrale e raccogliere lo strato superficiale delle cellule congiuntivali. Queste cellule, dopo aver raggiunto la loro fase finale di differenziazione, vengono continuamente sparse in lacrime 3 . Tre principali popolazioni di cellule sono presenti nei campioni IC: cellule epiteliali 4 , cellule calde 3 , 5 e tessuto linfoidale associato alla mucosa, ovvero cellule T efficaci associate all'epitelio o cellule dendritiche 6 . Cellule di superficie oculari in IC samPossono essere analizzati mediante microscopia, reazione a catena di polimerasi di polimerasi a reazione inversa-transcriptasi (RT-PCR) 7 . La citometria a flusso è stata recentemente usata per analizzare le cellule immunitarie raccolte raschiando la membrana IC 8 . È interessante notare che IC 6 , 9 è stato usato per valutare molte malattie della superficie oculare, tra cui la cheratoconjunctivitis sicca, la carenza di vitamina A, la pemfigoide cicatrici, la malattia atopica, la cheratoconjunctivite limbica superiore, la cheratoconjunctivite viverna e la metaplasia squamosa epiteliale. IC è stato utilizzato anche per valutare l'impatto delle lenti a contatto usurate, rilevare microbi superficiali oculari e verificare l'efficacia terapeutica e la tolleranza degli interventi terapeutici negli studi longitudinali 10 , 11 , 12 .
Il dispositivo medico (EyePrim) è supportato da un tipo di poliEterosolfone (PES) membrana da 0,2 μm, precedentemente convalidata per la tecnica della citometria oculare con citometria a flusso (flusso OSIC) e apre opportunità di utilizzare campionamenti longitudinali per monitorare la progressione della malattia e la risposta al trattamento ( ad es . Analisi dei leucociti intraepiteliali definiti come marker di malattia supposto per la fibrosi progressiva congiuntivale nella pemfigoide della membrana mucosa) 13 . I primi ricercatori hanno utilizzato filtri PES autoclavati che richiedevano l'impressione manuale. Di conseguenza, la resa era variabile e dipendente dall'utente. Il vantaggio di questo dispositivo medico è la facilità d'uso, la pressione standardizzata (Pa o N / m 2 ) e consente ripetibilità, riproducibilità e recupero cellulare coerente. Questa tecnica è utile in una clinica out-patient perché non è chirurgica, è facile da eseguire e veloce. Si tratta di un dispositivo medico di classe I (sterile) secondo la direttiva 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Richiede soloL'anestesia topica durante la procedura, che garantisce la manutenzione dell'integrità della superficie oculare. Dopo IC, le cellule possono essere trattate immediatamente per la citometria a flusso. Inoltre, è possibile che i tecnici e gli infermieri non oftalmologici siano addestrati per campionare la superficie oculare.
Nonostante il miglioramento del CI rispetto ad altre tecniche, rimangono diverse sfide. Ad esempio, potrebbero esservi variazioni dovute all'area del campionamento e alle differenze regionali nella congiuntiva bulbar a seconda della posizione dell'IC. Un'altra fonte di variazione è dovuta all'applicazione di diverse quantità di pressione durante l'IC. Altre questioni metodologiche riguardano la standardizzazione dell'elaborazione delle cellule: queste riguardano la durata e il metodo di fissazione e le condizioni di possibili stoccaggi che possono influenzare la stabilità del materiale campionato.
L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di sviluppare un metodo di isolamento dei campioni di impressione oculare thaT è facile da usare, non invasivo e può essere applicato alla caratterizzazione immunologica dei campioni clinici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si tratta di una tecnica facile, veloce e meno invasiva che può essere utilizzata nelle cliniche di out-patient per una profilatura immunitaria relativamente veloce in contrasto con le tecniche convenzionali come il raschiamento, la tamponatura, la pipettazione o la carta filtrante assorbente 1 , 2 . Una variante di questa tecnica è già stata utilizzata nelle impostazioni di ricerca 22 . La futura applicazione della metodologia proposta è quella di stratificare pazienti in studi clinici con malattie oculari, in particolare quelle che richiedono l'immunofenotipizzazione.
Una grande sfida con questa tecnica è la relativamente poche cellule immunitarie recuperate dopo la raccolta e lo strappo delle impressioni. Il numero totale di CD3 + T cellule recuperate da quattro impressioni per singolo varia da ~ 500 a 1.000 cellule. I campioni oculari sono stati lavati prima dell'analisi della citometria di flusso per un numero minimo di volte per evitare ulteriori perdite di celluleS. I passi critici e le sfide che rimangono all'interno del protocollo sono una raccolta efficiente di campioni oculari e una corretta raschiatura della membrana per ottenere numeri superiori di cellule. Tuttavia, questa limitazione è improbabile che si propaghi verso un determinato fenotipo immunitario. La risoluzione dei problemi effettuata qui per massimizzare la resa delle cellule era ridurre il numero di passi di lavaggio dopo e prima dell'incubazione degli anticorpi.
Ci sono altre limitazioni per l'utilizzo dell'IC. Nei pazienti con superficie oculare gravemente cheratinizzata o fibrose, come nella sindrome di Steven Johnson, il rendimento cellulare può essere anche inferiore a quello di questo studio. La percentuale di cellule immunitarie può cambiare se i campioni vengono memorizzati anziché analizzati nello stesso giorno. È difficile prevedere se determinati tipi di cellule sono più resistenti all'archiviazione rispetto ad altri. Studi precedenti hanno riportato elevati livelli di espressione HLA-DR nelle cellule epiteliali congiuntivali 23 , pertanto sarebbe interPer valutare la correlazione tra HLA-DR e livelli di cellule immunitarie specifiche. Le cellule immunitarie possono anche essere associate al livello di espressione delle chemochine. Questi temi dovrebbero essere affrontati negli studi futuri.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero ringraziare Nandini Nallappan e Sharon Yeo per aver contribuito con i passi tecnici. Lo studio è stato finanziato da una concessione di start-up per KGC presso la Lee Kong Chian School of Medicine, l'Università Tecnologica di Nanyang e da un Senior Clinician Scientist Award del National Medical Research Council (NMRC) di Singapore Ministry of Health a LT (NMRC / CSA / 045/2012) e da una sovvenzione del NMRC e somministrata dal National Health Innovation Centre a KGC e LT (NHIC-12D-1409007).
Materials
| Reagents | |||
| anti-human CD3 BV510 | BD Biosciences | 563109 | |
| anti-human CD4 APCH7 | BD Biosciences | 641398 | |
| anti-human CD45RO PECy7 | BD Biosciences | 337168 | |
| 7-AAD solution | BD Biosciences | 555816 | |
| anti-human CCR7 PE | BD Biosciences | 552176 | |
| Pippetes | Eppendorf | NA | |
| Local Anaesthesia | Alcaine | NA | |
| Fluorescein sodium solution | Bausch & Lomb U.K Limited | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Keratograph 5M | Oculus | NA | |
| Slit lamp BioMicroscope | Haag Streit | BM900 | |
| EyePrim | Opia Technologies | NA | |
| FACS Verse | BD BioSciences | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| GraphPad 6.0 | Prism | NA | |
| FACSVerse analysis software | BD | NA |
References
- Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
- Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).
- Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
- Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
- Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
- Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
- Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
- Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
- Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
- Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
- Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
- Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
- Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
- Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
- Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
- Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
- Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
- Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
- Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312 (2017).
- Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
- Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).
