从结膜分离和表型细胞的非侵入性方式

本研究中使用的所有眼部样品均由新加坡国家眼科中心的眼科诊所收集，由SingHealth集中制审查委员会和新加坡南洋理工大学机构审查委员会批准。 注意：受试者进行临床测试以评估炎症的程度和IC执行前泪液功能障碍的严重程度。临床试验包括用诊断仪器评估的非侵入性撕裂破裂时间（NI-TBUT） 14和结膜发红（充血） 15,16 ，Schirmer测试17 ，眼睛干燥的标准患者评估（SPEED）问卷18和角膜染色19 。 IC收集眼睛样本确定临床状态后，麻醉通过施用1-2滴的局部麻醉，盐酸普拉卡因，上肢结膜和下穹窿，参与者的眼睛。等待4 – 5分钟，麻醉剂的刺痛感消失。 从两个印象细胞学装置收集来自鼻和颞结节结膜的样品。 注意：一个设备用于收集两个印象样本。在这里，使用两个装置来收集四个印模膜。 将印象细胞学装置切向地置于结膜上。轻轻按下按钮，按住2 – 3秒。 注意：设备附带膜。按下按钮后自动释放压力。释放压力只需几秒钟就可以移除设备。 将膜放入含有1mL培养基的微量离心管（Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI）+ 10％胎牛血清（FBS）+ 1％青霉素 – 链霉素（Pen Strep））。 通过用10μL移液管尖端连续刮擦约1分钟，将细胞从装置的膜上分离出来。 注意：当膜的表面变得不均匀时，刮擦完成。来自每个膜的细胞数量是可变的（100-500个细胞/膜）。在收集的2 – 3 h内处理样品。 2.流式细胞仪免疫分型细胞在室温下将细胞以400xg离心5分钟以除去培养基。用50μL流式细胞仪染色缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS）+ 0.05％牛血清白蛋白（BSA））重悬细胞沉淀。 具有一组抗体的染色细胞（ 例如 ，CD3亮紫（BV）510（UCHT1），CD4别藻蓝蛋白-H7（APC-H7）（SK3），CCR7藻红蛋白（PE）-A，CD45RO PE-花青素7（PE- Cy7）-A，活/死细胞标记7-ADD）在室温下20-30分钟黑暗。根据制造商的方案直接从库存中使用抗体。 注意：对于抗体浓度，使用2.5μLCD3-BV510，1.25μLCD4-APC-H7，CD45RO-PE-Cy7,7-AAD和10μLCCR7-PE。使用外周血单核细胞（PBMCs）滴定不同浓度的抗体。对于滴定，采取制造商的方案中提及的抗体浓度，并使用推荐浓度的一半和四分之一。使用最低浓度的抗体避免溢出到其他荧光染料通道。用所提及的抗体浓度观察到清除信号。补偿是通过首先根据Williams 等人提到的方案测试PBMC进行的。 20对于测试，将PBMC与本文使用的相同抗体组合孵育，并通过比较单次和多次抗体染色来补偿。 孵化周期后od，向管中加入1mL染色缓冲液，充分混合，并在室温下以450xg离心5分钟。将细胞悬浮于200μL染色缓冲液中。 在流式细胞仪上运行样品。 在获取数据之前，请使用细胞仪设置和跟踪（CS＆T）珠校准流式细胞仪通道电压，以按照制造商的说明在不同日期对数据采集进行归一化。 打开流式细胞仪数据采集软件，点击“设置＆QC”按钮，选择正确的CS＆T珠批号，加载珠，然后点击“开始”按钮。 在将样品加载到机器前，轻轻敲打管，重悬细胞。打开数据采集软件，点击“预览”。当阈值稳定时，单击“获取”。监控样品级别，当样品用尽时点击“停止”。 注意：每个样品获取10,000个事件。 </l我> 获取10,000个事件后，在工作表中生成SSC-A和FSC-A点图。 单击“多边形门”按钮，在FSC-A值> 5 x 10 4的所有事件上绘制一个门（这是P1），以排除碎片。点击“创建点图”按钮生成一个新的点图，右键点击斑点，选择“属性”打开“绘图编辑器”窗口，然后选择“P1”。点击P1点图的x轴上的FSC-A，将其更改为CD3-BV510。画一个“多边形门”来选择CD3 +群体并命名为“P2”。 点击“创建点图”按钮生成一个新的点图，右键点击斑点斑点，选择“属性”打开“绘图编辑器”窗口。点击P2点图的x轴上的FSC-A，将其更改为7-AAD。为7-AAD -人口绘制“多边形门”，并选择“P3”。 P3这里是CD3 +活细胞点击“创建点图”按钮生成一个新的点图，右键点击斑点斑点，选择“属性”打开“绘图编辑器”窗口。点击P3点图的y轴上的x轴上的CD3-BV510和CD4-APCH7。在象限的上下两边绘制矩形门，并分别选择“P4”和“P5”。 P4是活CD3 + CD4 + ，P5是活CD3 + CD4 – T细胞。 点击“创建点图”按钮生成一个新的点图，右键点击斑点斑点，选择“属性”打开“绘图编辑器”窗口。单击x轴上的CD45RO PE-Cy7和P4和P5图的y轴上的CCR7-PE。在这个点图上画“四门”。 注意：这里的左上侧，右上侧，右下侧和左下方的象限是天真的，中央记忆（T CM ），effector记忆（T EM ），终末分化的效应记忆（T EMRA ）T细胞。