De WinCF Model - Een goedkope en handelbaar microkosmos van een Slijm Plugged bronchiolus de Microbiologie van longinfecties Studie
Summary
De mucuspluggen van cystische fibrose (CF) patiënten zijn een ideale omgeving om microbiële pathogenen te bloeien. Het manuscript beschrijft een nieuwe methode om de CF-longmikrobiome te bestuderen in een omgeving die naboots waar ze ziekte veroorzaken en hoe veranderingen van chemische omstandigheden microbiële dynamiek kunnen veroorzaken.
Abstract
Veel chronische luchtwegziekten leiden tot slijmvlies van de luchtwegen. Longen van een individu met cystische fibrose zijn een voorbeeldig geval waarbij hun mucus-aangesloten bronchiolen een gunstige leefomgeving voor microbiële kolonisatie vormen. Verschillende pathogenen gedijen in deze omgeving interageren met elkaar en rijden veel van de symptomen geassocieerd met CF-ziekte. Net als elke microbiële gemeenschap hebben de chemische omstandigheden van hun leefgebied een belangrijke impact op de gemeenschapsstructuur en dynamiek. Bijvoorbeeld, verschillende micro-organismen bloeien in verschillende niveaus van zuurstof of andere opgeloste concentraties. Dit geldt ook in de CF-long, waar zuurstofconcentraties worden geacht gemeenschapsfysiologie en -structuur te runnen. De hier beschreven methoden zijn ontworpen om de longomgeving na te bootsen en pathogenen te laten groeien op een manier die vergelijkbaar is met die waaruit zij ziekte veroorzaken. Manipulatie van de chemische omgeving van deze microben wordt dan gebruikt om te bestuderen hoe de chemieString van longinfecties regelt haar microbiële ecologie. De methode, het WinCF-systeem, is gebaseerd op kunstmatig sputummedium en smalle capillaire buizen die bedoeld zijn om een zuurstofgradiënt te verschaffen die vergelijkbaar is met die welke bestaat in mucus-aangesloten bronchiolen. Manipulatie van chemische condities, zoals de media pH van de sputum of de antibiotica druk, maakt het mogelijk om de microbiologische verschillen in die monsters te visualiseren met behulp van gekleurde indicatoren, kijken naar gas- of biofilmproductie of het extractie en sequentiebepaling van de nucleïnezuurgehaltes van elk monster.
Introduction
De methode beschreven in dit manuscript heet het WinCF-systeem 1 . Het overkoepelende doel van WinCF is een experimentele setup te geven die het milieu kan simuleren van een mucus-gevulde longbronchiole. Dit zorgt voor een tracteerbaar systeem om microbiële pathogenen van longziekten te bestuderen met een fenomeen van mucus hypersecretie, waaronder cystische fibrose (CF), chronische obstructieve longziekte (COPD), astma en anderen. De procedure is speciaal ontworpen voor de studie van CF, die wordt gekenmerkt door mutaties die leiden tot longziekten, die dik en moeilijk worden, waardoor bronchiolen en andere kleine doorgangen met slijm 2 worden gevuld. Dergelijke blokkades in de longinhibitgasuitwisseling omdat inhalatielucht niet meer veel alveoli kan bereiken en ook een habitat voor bacteriële kolonisatie 3 , 4 verschaft. Het onvermogen om microbiële groei te voorkomen in deOverdreven longslijm leidt uiteindelijk tot de ontwikkeling van complexe chronische infecties van de luchtweg. Deze gemeenschappen bevatten een verscheidenheid aan organismen, waaronder virussen, schimmels en bacteriën zoals Pseudomonas aeruginosa , die allemaal met elkaar 5 , 6 , 7 , 8 interageren. De werkzaamheid van de CF-longmicrobiome wordt geacht betrokken te zijn in flappen van symptomen genaamd pulmonale exacerbaties 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF maakt het mogelijk om het gedrag van het microbiële gemeenschap rond deze exacerbaties te onderzoeken en wordt nu uitgebreid om te fungeren als basis experimenteel systeem om longmicrobiële ecologie te bestuderen. Traditioneel zijn exacerbaties bestudeerd door middel van directe analyse van monsters uit de long. Veel confounding factoren maken directe analyse van microbiële bUitwerking op de longen, met het WinCF-systeem, worden veel van deze factoren verwijderd en kan het gedrag van de longmicrobiome directer bestudeerd worden, waardoor een fijne analyse van de bacteriële activiteit in een slijmvliesbronchiole mogelijk is.
Het WinCF-systeem biedt een methode om bacteriën te groeien en te analyseren op een manier die de longomgeving effectief naboots. Traditionele methoden voor het kweken van longbacteriën betroffen vaak cultuurmonsters op traditionele agarplaten. Deze methodes laten de monsters open staan voor atmosferische zuurstof, omdat ze niet in aanmerking komen voor de hypoxische en vaak anoxische aandoeningen die worden gevonden in longbrongchiolen die zijn aangesloten op mucus 12 , 13 . Culturen op agar onder aërobe omstandigheden is niets zoals het milieu van de CF-long en kan artsen en onderzoekers misleiden over het gedrag van de pathogenen die ze proberen te behandelen. Daarnaast zijn de voedingsstoffen beschikbaar voor bacteriën op agarplatenZijn verschillend van die welke beschikbaar zijn in het werkelijke sputum, dat in WinCF wordt verantwoord door gebruik te maken van kunstmatige sputum media (ASM). Zoals blijkt uit de Pseudomonas culturen in Sriramulu et al. 14 bevat ASM een specifieke reeks componenten die de beschikbare middelen voor sputummicroben nabootsen en ook de fysieke consistentie van sputum repliceren. Omdat een zieke long een specifieke microbiome heeft, zou de studie van dergelijke micro-organismen ideaal ook in de specifieke condities van de long moeten plaatsvinden.
Het WinCF systeem zorgt voor snelle analyse en gemakkelijke manipulatie van de experimentele condities om microbiële veranderingen te waarnemen zoals die in een werkelijke longbongchiole voorkomen. Deze techniek zorgt voor de inenting van een groot aantal aanverwante steekproeven, waaronder sputum, speeksel, andere lichaamsafscheidingen en pure of gemengde bacterieculturen. De aard van de experimentele opstelling zorgt voor onmiddellijke visuele interpretatie vande microbiële gemeenschap gedrag en is ontworpen om eenvoudig stroomafwaarts toepassen van meerdere microbiologische en omics procedures mogelijk. Dergelijke studies zijn belangrijk omdat bacteriële gemeenschap samenstelling verandert op basis van de fysisch-chemische omstandigheden van hun omgeving. Met WinCF de chemische omstandigheden van de media kan worden gemanipuleerd om de effecten op de bacteriële activiteit te analyseren. Bijvoorbeeld kan de zuurgraad van het medium worden gewijzigd voorafgaand aan inoculatie met een monster. Na incubatie kan de bacteriële activiteit in elk van deze voorwaarden direct worden vergeleken en kunnen conclusies worden getrokken over bacteriën in sputum monsters die zich in reactie op variërende pH. Hier, schetsen we de procedures voor de toepassing van de WinCF systeem en voorbeelden van de manier waarop de media chemie kan worden gemanipuleerd om de effecten op de longen microbiome bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De microbiologische make-up van een long met CF bevat een grote verscheidenheid aan organismen, maar de omstandigheden in de long hebben waarschijnlijk een significante invloed op wat voor soort microben kan overleven en 13 , 15 bloeien. Specifieke mechanismen waardoor deze omstandigheden veranderen en de precieze effecten die ze op de longmikrobiomen hebben, zijn over het algemeen onduidelijk. In deze experimentele methode presenteren we een analyse van microbi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zouden graag de Vertex Pharmaceuticals en de Cystic Fibrosis Research Innovation Award erkennen voor de financiering van R. Quinn en de NIH / NIAID voor financieringsbijdrage 1 U01 AI124316-01, een systeembiologische benadering voor de behandeling van multi-drug resistente pathogenen. Wij danken ook het ministerie van Werktuigbouwkunde en Ruimtevaarttechniek aan de UCSD-masteropleiding voor de mechanische ingenieurswetenschappen om de samenwerking met de technische aspecten van dit werk te vergemakkelijken.
Materials
| Color-Coded Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-260943 | |
| Cha-seal Tube Sealing Compound | Kimble-Chase | 43510 | |
| Mucin from porcine stomach | Sigma | M1778 | |
| Ferritin, cationized from horse spleen | Sigma | F7879 | |
| Salmon sperm DNA Sodium salt (sonified) | AppliChem Panreac | A2159 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning cellgro | 25-025-CI | |
| MEM Amino Acids | Cellgro | 25-030-CI | |
| Egg Yolk Emulsion, 50% | Dalynn Biologicals | VE30-100 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P2157500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271500 | |
| 15mL centriguge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-666 | |
| 50mL centrifuge tubes with Printed Graduations and Flat Caps | VWR | 89039-656 | |
| 1.5mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-150-R | |
| 2.0mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-200-C |
References
- Quinn, R. A., et al. A Winogradsky-based culture system shows an association between microbial fermentation and cystic fibrosis exacerbation. ISME J . 9, 1024-1038 (2015).
- Quinton, P. M. Cystic fibrosis: impaired bicarbonate secretion and mucoviscidosis. Lancet. 372 (9636), 415-417 (2008).
- Harrison, F. Microbial ecology of the cystic fibrosis lung. Microbiology. 153 (Pt 4), 917-923 (2007).
- Caverly, L. J., Zhao, J., LiPuma, J. J. Cystic fibrosis lung microbiome: Opportunities to reconsider management of airway infection. Pediatr pulmonol. 50, S31-S38 (2015).
- Blainey, P. C., Milla, C. E., Cornfield, D. N., Quake, S. R. Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis. Sci Transl Med. 4 (153), 153ra130 (2012).
- Willner, D., et al. Spatial distribution of microbial communities in the cystic fibrosis lung. ISME J. 6 (2), 471-474 (2012).
- Delhaes, L., et al. The airway microbiota in cystic fibrosis: a complex fungal and bacterial community–implications for therapeutic management. PloS one. 7 (4), e36313 (2012).
- Rogers, G. B., et al. D. Bacterial diversity in cases of lung infection in cystic fibrosis patients: 16S ribosomal DNA (rDNA) length heterogeneity PCR and 16S rDNA terminal restriction fragment length polymorphism profiling. J clin microbiol. 41 (8), 3548-3558 (2003).
- Stenbit, A. E., Flume, P. A. Pulmonary exacerbations in cystic fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (6), 442-447 (2011).
- Twomey, K. B., et al. Microbiota and metabolite profiling reveal specific alterations in bacterial community structure and environment in the cystic fibrosis airway during exacerbation. PloS one. 8 (12), e82432 (2013).
- Carmody, L. A., et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation. Ann. Am. Thorac. Soc. 10 (3), 179-187 (2013).
- Worlitzsch, D., et al. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109 (3), 317-325 (2002).
- Cowley, E. S., Kopf, S. H., LaRiviere, A., Ziebis, W., Newman, D. K. Pediatric Cystic Fibrosis Sputum Can Be Chemically Dynamic, Anoxic, and Extremely Reduced Due to Hydrogen Sulfide Formation. mBio. 6 (4), e00767-e00715 (2015).
- Sriramulu, D. D., Lünsdorf, H., Lam, J. S., Römling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54 (Pt 7), 667-676 (2005).
- Quinn, R. A., et al. Biogeochemical forces shape the composition and physiology of polymicrobial communities in the cystic fibrosis lung. mBio. 5 (2), (2014).
