质谱法和基于发光的-途径表征阶段我代谢能力的<em>体外</em>细胞培养

注：代谢活性测定的一般工作流程如图2所列。这个工作流程的每一步是随后在接下来的段落中详细说明。试剂和设备的详细表格中材料的表中给出。 图2：工作流中的代谢探针检测。将细胞接种并生长到足够密度。甲CYP诱导步骤可能依赖于所测定的酶活性是必需的。探针底物和抑制剂添加至细胞培养物。温育期后，将培养基收集用于分析和裂解细胞用于蛋白质定量。该介质处理以用于通过质谱法或发光测定的探针基板的代谢产物的分析。广告/ 55502 / 55502fig2large.jpg”目标=‘_空白’>点击此处查看该图的放大版本。 1.细胞培养 图3：肝细胞系培养物的光透射显微照相。在这个协议5中所述的细胞系通常分化与培养胆管和肝细胞之间的50％的分割（100×）。比例尺=100μm左右。 请点击此处查看该图的放大版本。 肝细胞株培养 注：将市售的肝细胞系用作代谢感受态细胞的一个例子。该细胞系从由病毒感染引起7肝癌衍生。在融合时，该细胞系分化为cholangiocyte-和肝细胞样细胞（ 图3），并且进一步的细节可以在Guillouzo 7中找到。 2％DMS​​O的向培养基中包含支持多种的CYP的该细胞系和表达的分化。 从液氮中取出与细胞低温小瓶中，并放置在运输干冰。转移到冷冻管的水浴预热至37℃1-2分钟，并在层流罩放置之前消毒用70％乙醇小瓶的外部。 虽然在无菌条件下工作时，小心地打开低温小瓶以释放任何多余的压力和低温小瓶中的内容吸取到10ml管中在37℃下填充有9mL的预温 – 威廉姆斯E培养基。 离心溶液10分钟，在室温下400×g离心，弃去上清液，并将细胞重新悬浮于5mL的专有的解冻介质预加热，在37℃，补充有谷氨酰胺或谷氨酰胺补充物（2mM的终浓度）（Williams的E +补充谷氨酰胺+解冻补充剂）。 使用500微升等分试样用细胞计数器或任何其他合适的细胞计数技术计数活细胞。 种子24孔胶原包被的板中的细胞以0.6×10 6个活细胞/孔的密度在0.5毫升解冻介质的最终体积。 放置在培养箱中的板（S）在37℃下用5％/ 95％CO 2 /空气和100％相对湿度。 接种细胞24个小时后，更换用0.5ml预热维护/代谢工作介质的（Williams的E +补充谷氨酰胺+代谢补充物（该培养基已包含DMSO））的平台。改变介质每两天。 在培养数天的细胞形成一个亚汇合骨小梁结构（ 图3）。最佳代谢活性7天和10之间通常观察到，并且在第4天最低。 图4：在空气-液体界面8生长爱茜蓝染色呼吸道细胞的截面图。 纤毛，粘液生产和基底细胞清晰可见。比例尺=250μm左右。 差异化的呼吸道上皮细胞培养 注：该协议是示出在气-液界面上的插入件8（ 图4）生长的市售完全分化的主气道上皮细胞。组织培养保留了粘膜纤毛表型和细胞极性8。细胞可以是鼻或支气管来源的。在这里，用人类的鼻腔细胞。将细胞在24培养板格式传送插入在空气 – 液体界面。为了便于运输和避免介质溢出插入件随嵌入在用培养基混合琼脂糖基质基底部分。 在递送单元中，在一个干净的层流罩放置之前消毒含有24将用70％乙醇溶液将板。 通过加入预热的700μL专有培养基制备的无菌24孔板中。 使用无菌镊子轻轻从琼脂糖基质撞出所述插入单元插入转移到新的板预先加载平台。 放置在培养箱中的板（S）在37℃下用5％/ 95％CO 2 /空气和100％相对湿度。 每2天插入物转移到新的无菌24孔板预装载有700μL的暖气道专有细胞培养基。 评估气道组织的使用方法，如经上皮电阻（TEER），或完整性纤毛使用装有实时视频成像系统9的显微镜拍频（CBF）。 TEER和CBF的测量在10 Kuehn的描述。 2. CYP活性定量在细胞培养物注意：作为一般规则，优选溶剂如DMSO和甲醇可用于在本文所提出的不同的代谢探针和抑制剂制备储备溶液。然而，建议在培养基中的最终DMSO浓度保持在最低水平（1％或更低），因为高浓度的能抑制代谢酶。如果可能的话，还建议使用无酚红和无血清培养基中与代谢探针的温育过程中，因为酚红可以用的CYP和II期酶的活性和血清组分如白蛋白可降低探针的可用性干涉。它并不总是能够严格遵守这些准则。例如，呼吸道细胞培养基是专有的，含有酚红。专有肝细胞系的代谢平台7，因为它在细胞采取肝细胞样表型需要已经包含高于1％DMSO。 注：最后，在这里，术语特异性探针/抑制剂使用，但这个术语有慎重考虑。事实上，这是非常罕见的代谢探针是酶底物排斥。这里所描述的探针，然而，对于它们的目标酶的高亲和性，并因此被认为是活性的可靠标记。 代谢探针，诱导物，和抑制剂 使用基于质谱法探头注：在本节描述的探针和抑制剂是合适的，以测试CYP2As 11的活性，CYP1A2 12，REF“> 13，CYP2B6 7，14，CYP2F1 15，图 16和CYP2E1 17由UPLC-MS分析。探针，抑制剂和相应CYP在表1中具有相应的参考文献中描述。 表1还列出了CYP的代谢产物这是通过质谱法进行定量的活性。所有涉及组织培养和解决方案的组织培养中的工作是在一个无菌组织培养橱中进行。储备溶液可以在DMSO中的所有探针底物来制备。 在实验之前，只对代谢探针准备两个串联电池单元的插入孔或插孔中，使用一个系列的用于抑制实验，其他。制备的第三系列的细胞作为介质空白对照。它们可以是在单独的板或在用最少的三次重复的相同平板上。板的一例铺设出被呈现在图5中。 在实验的当天，代替以新鲜培养基的450微升的细胞培养基。 制备在无菌罩10倍浓度使用细胞培养基通过以下方法解决。混合10×CYP探针，10X CYP抑制剂，和10倍的CYP抑制剂加10X探针。 注：抑制剂和探针的硕士储备溶液可以在100％DMSO来制备（ 例如 ，1000倍的股票），并进一步在培养基中稀释到，以避免超过1％的细胞培养物中的最终DMSO浓度获得10倍的溶液。其旨在用于与细胞孵育的最后1X浓度示于表1中 。 过滤用0.2μm注射器过滤器不同10X探针溶液。 添加培养基的50μL含有10×CYP抑制剂与系列为抑制实验和预温育30分钟而制备的细胞。 – [RE放置细胞的培养基中的抑制系列用新鲜培养基的450μL，并添加含有10×CYP抑制剂和10X探针基底介质的50μL。 添加到其它单元与10倍的探针基底介质的50μL，并添加在培养基中稀释（ 例如 ，DMSO）到空白细胞对照车辆的等效量， 如图5。 孵育细胞0 – 5分钟（时间0，背景对照），并在细胞培养箱16小时。 注：此孵育时间与呼吸道细胞和肝细胞系成功地使用;然而新鲜原代肝细胞具有较高的代谢能力，所述细胞制剂的质量和供体的遗传组成，因此较短的时间未决（ 例如 ，2〜4小时）可能是合适的。它总是建议测试不同的细胞系或细胞类型时执行的时间过程实验。 在潜伏期，科尔结束ECT在用于探针的代谢产物的定量单独标记的管的平台。冻结将来的处理中。 裂解细胞的蛋白定量。 注意：任何标准的蛋白定量试剂盒和协议适合于该步骤。 BCA是一个合适的选择。这个步骤是可选的，如果细胞在另一个试验中使用。 媒体处理 注：从孵化阶段收集到的介质包含父探测化学以及它的代谢产物。要衡量一个特定CYP活性只有感兴趣的CYP催化反应的产品应该被量化。阶段I代谢产物通常与II期代谢（缀合）串联处理，因此不能作为这样来检测。因此，为了获得一个CYP活性的最精确的定量，一个去缀合步骤是必需的，以消除任何二期代谢修改。由于第一阶段的共轭我代谢产物通常涉及葡糖醛酸化或硫酸化，去缀合是通过处理的样品的由葡糖醛酸酶实现和硫酸酯酶18。葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶活性是在pH 4.5-5.0和硫酸酯酶活性是在pH 6.0-6.5最高正在实现pH依赖性与最高葡萄糖醛酸酶的活性。因此，此步骤需要调节pH。在这里所描述的方法中，我们使用pH条出于实际的原因，因为大多数pH计探针不适合在1.5mL微离心管中测量的pH值。可商购的pH值条可以以低到0.3至0.2个pH单位的分辨率被发现。 转移温育培养基的250微升到1.5mL微管中，并添加4-甲基伞形酮内标储备溶液以达到100nM的最终浓度。 通过添加1M盐酸调节培养基的pH至4.5-5.0。添加盐酸的1μL的时间和pH值验证通过吸取2μL培养基到pH试纸。达到5.0的pH值通常需要不超过5-10μL的1M HCl的更多。 添加从罗马蜗牛 β葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶的150个单位（1.8μL的85000单位/ mL储备的），并在37℃下孵育1个小时。通过加入冷的甲醇的250μL终止反应（-20℃）。在-20℃或过程进一步存储样本。 使用真空离心机在45℃下蒸发溶剂。水溶液：用500微升30％乙腈的重构样本。将样品准备用于质谱分析，并且可以存储在安伯·格拉斯小瓶中-20℃。 基于质谱法量化 注：所有的UPLC和质谱仪设置在专用参考表1详细。对于定量分析，建立校准曲线是必需的。卡利bration曲线是通过运行的化合物的公知的稀释范围进行量化获得。在这种情况下，经10个不同浓度（ 表2），其中至少6的应该是线性范围19的20％之内所产生的校正曲线。检测的最低水平被确定为给出一个信号大于或等于3倍的平均背景信号的最低浓度。定量的最低水平被确定为最低浓度的其给出信号大于或等于10倍两者都确定在至少3个与一式三份样品独立实验的平均背景信号的样本。 根据表2制备在组织培养基中的合成代谢产物的连续稀释液，包括内部标准。的每标准稀释250μL的最终体积是足够的。 蒸发的标准系列稀释液作为第一描述EP 2.1.2.4，重悬在30％乙腈的体积：相当于水介质之前蒸发的体积（ 例如 ，250微升30％乙腈：水如果起始标准溶液为介质的250微升）。 添加每个连续稀释的标准的250μL成琥珀色UPLC玻璃小瓶用于注射在UPLC-MS自动进样器。 添加测试样品（250微升），以琥珀色UPLC小瓶，并放置在自动进样器UPLC。 随机所有的小瓶。 注意：我们使用的质谱仪配置是耦合到UPLC在补充表1详细混合三重四极/线性离子阱质谱仪。其它平台会有不同的软件和配置，但会遵循类似的步骤来执行量化。 运行使用补充的表1视具体探针量化详述的设置UPLC-MS。 使用了“定量-建立定量方法”，在质谱仪定量工具工具（ 材料的表 ），以生成从所取得的合成标准和内标校准曲线。 使用“定量向导”选择样品批次和样品量化和执行“定量方法”。质谱仪定量软件显示与每个测试样品中的目标化合物的定量值的电子表格。 使用基于荧光探针方法 注意：发光的探针来测量一系列CYP活动的可商购获得;然而，并不是所有的都适合基于细胞的测定。在这里，被呈现给测量CYP1A1 / CYP1B1活性的协议。 CYP1A1 / 1B1被选择来说明如何测定诱导的CYP的活性和得到的如何发光的探针可用于作为ALTER一个例子原产于质谱为基础的方法。 表3总结了我们用于气道细胞和肝细胞系中的浓度和温育时间;但是，那些可能需要适用于其他类型的细胞。其他发光的探针是可商购的，并且可以用作用于各种的CYP的基材。 准备足够的细胞以包括非诱导控制，感应测试，和感应+抑制剂试验。板布局的一个例子示于图5B。 为了诱导CYP1A1 / 1B1，孵育所述细胞用10nM的TCDD在介质一段72个小时的最终浓度（24至48小时较短的时间也可以是合适的）。 注意：二恶英是一种致癌物质和致畸剂。穿戴适当的防护设备，检查供应商材料安全数据表，并在使用前进行风险评估。 在此之后，除去介质，用PBS冲洗3次井，并添加一些新鲜的培养基。 镨IOR到温育与发光的报告探针的细胞，预孵育诱导的细胞的子集指定为30分钟，用10μMCYP1A1 / 1B1抑制剂，α萘黄酮的终浓度，在平台。 在50μM的终浓度添加发光的探针LUC-CEE（荧光素6'-氯乙基醚），以使在非诱导，诱导和诱导的+抑制剂的细胞。 孵育在细胞培养箱中4个小时。在孵育时间结束时收集的发光的探针定量的媒介。 转移25μL培养基至白色不透明96孔板中，并添加由制造商提供的荧光素检测试剂的25μL。孵育在室温下20分钟。读板立即用光度计。 用PBS冲洗细胞并裂解总蛋白定量。 注意：这一步是可选的，如果活细胞被保留为将来的实验。一世t是重要然而需要注意的是诱导例如TCDD是有毒的，会损害细胞。 表1： 与他们相应的酶代谢探针，产品和抑制剂的名单。分子量，并与气道和肝细胞中使用推荐的浓度也表示。 请点击此处查看该图的放大版本。 图5：建议的24孔平板布局来执行CYP测定。 （A），用于组成型表达的CYP的推荐布局包括用于空白介质的一系列孔，代谢探针，和代谢探针加抑制剂。该布局可通过正在测试的时间点的数量相乘。 （B）可诱导的CYP的示例布局包括用于介质空白与探针孵育，并与探针和抑制剂孵育的一系列孔，代谢探针仅控制，诱导细胞（ 例如 ，用TCDD）。 表2： 用于校准曲线以及相应的检测限和定量限合成标准稀释 。使用稀释范围可基于质量分析平台和灵敏度上。在这里，我们使用连接到UPLC混合三重四极/线性离子阱质谱仪。 请点击此处查看这个更大的版本数字。 表3：发光的探针，诱导剂和缓蚀剂的CYP1A1 / 1B1测定。 请点击此处查看该图的放大版本。