وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية
Summary
المرونة بتكوين تلعب دورا حاسما في وظيفة البروتين. هنا، نحن تصف استخدام تأين بالإرذاذ الإلكتروني مطياف الكتلة وقت حل جانب لصرف الهيدروجين الديوتيريوم للتحقق التغييرات الهيكلية السريعة التي تدفع وظيفة في البروتينات أمر والمختلين.
Abstract
وقد البروتينات المختلين جوهريا (النازحين) لفترة طويلة تحديا لعلماء الأحياء الهيكلية نظرا لعدم وجود عناصر البنية الثانوية مستقرة. الهيدروجين الديوتيريوم تبادل (HDX) تقاس بمقاييس الوقت السريعة هي مناسبة فريدة للكشف عن الهياكل والشبكات الرابطة الهيدروجينية التي يتم لفترة وجيزة بالسكان، مما يسمح لتوصيف المتشاكلات عابرة في الفرق المحلية. اقتران HDX لقياس الطيف الكتلي يقدم العديد من المزايا الرئيسية، بما في ذلك حساسية عالية، وانخفاض استهلاك عينة وأي قيود على حجم البروتين. وقد تقدمت هذه التقنية بشكل كبير في العقود القليلة الماضية، بما في ذلك القدرة على رصد مرات العلامات HDX على مقياس الوقت ميلي ثانية واحدة. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال دمج سير العمل HDX في الصعود إلى منصة ميكروفلويديك السكن وmicroreactor البروتيني الحمضية، ونحن قادرون على توطين الخصائص الحيوية على مستوى الببتيد. في هذه الدراسة، في الوقت حل التأين electrospray الطيف الكتلي (TRESI-MS) يقترن إلى HDX واالصورة المستخدمة لتقديم صورة مفصلة للهيكل المتبقية في بروتين تاو، فضلا عن التحولات بتكوين الناجم على hyperphosphorylation.
Introduction
على مدى العقود العديدة الماضية، بذلت أوجه التقدم الكبير في تطوير التقنيات التحليلية لقياس بنية البروتين وديناميات 1، 2، 3، 4. في حين تبقى الأشعة السينية البلورات الأداة الرئيسية لتحديد بنية البروتين، وهناك حاجة تركيزات عالية من البروتين ومطلوب الأمثل واسعة لإنتاج بلورات ذات جودة الحيود. البروتينات التي يصعب بلورة مثل البروتينات المرتبطة الغشاء والمختلين جوهريا قد كلاسيكي تمت دراستها عن طريق تبادل الهيدروجين الديوتيريوم (HDX) NMR 5. ومع ذلك، في العقود الأخيرة، واقتران من تأين بالإرذاذ الإلكتروني الطيف الكتلي (ESI-MS) لHDX اكتسبت شعبية بسرعة 6 و 7.
قياس الطيف الكتلي يقدم حلالكثير من القيود التي تفرضها البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي. على وجه الخصوص، MS حساس للغاية (نانومتر لتركيزات ميكرومتر مطلوب)، وليس هناك عمليا أي حد على حجم البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ارتفاع دورة العمل من تحليل MS تتيح إمكانية دراسة البروتينات لأنها تخضع لدوران الأنزيمية، misfolding، complexation وغيرها من العمليات البيولوجية ذات الصلة. وغالبا ما تحدث هذه العمليات على ميلي ثانية واحدة على نطاق والمرة الثانية ويتطلب خلط السريع الكواشف قبل التحليل.
تطوير وقت حل التأين electrospray (TRESI) من خلال ويلسون وKonermann في عام 2003 ردود فعل سمح التي يتعين رصدها في وقت شبه حقيقي من قبل ESI-MS. الإعداد الخاصة بهم أدرجت خلاط الشعرية مع قابل للتعديل بشكل مستمر رد فعل حجم الغرفة 8. يتكون الجهاز من اثنين من الشعيرات الدموية متحدة المركز، مع الشعرية الداخلي مختومة والشق يقتطع من جانبها السماح لخلط داخل الضيق بين capillarذ الفضاء من الدرجة الأولى لنهاية الشعرية الداخلي (عادة 2 مم). عندما يطبق على التجارب HDX، الشعرية الداخلي يحمل البروتين من الفائدة، والشعرية الخارجي يحمل العلامات D 2 O الحل الذي ثم يخضع لخلط مع البروتين قبل الدخول إلى دائرة رد الفعل قابل للتعديل يسمح HDX وضع العلامات قبل النقل المباشر في ESI مصدر.
لفترة وجيزة، تعتمد على الهيدروجين HDX أميد العمود الفقري تمر التبادل مع ذرات الديوتيريوم في حل 9 و 10. تبادل هو قاعدة المحفز في درجة الحموضة الفسيولوجية، مع حمض الحفز أصبحت سائدة في درجة الحموضة أقل من حوالي 2.6. ويستند سعر الصرف على أربعة عوامل رئيسية هي: درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وسهولة الوصول المذيبات وضمجزيئي الرابطة الهيدروجينية. كما يتم الاحتفاظ اثنين من العوامل السابقة ثابت في كافة مراحل التجربة، وسعر الصرف، وخاصة في المناصب أميد الببتيد العمود الفقري، هو في المقام الأول dependenر على بنية البروتين 11. مطوية بإحكام المناطق ذات الشبكات الرابطة الهيدروجينية واسعة ومستقرة في α-اللوالب وβ اوراق ستتناول الديوتيريوم في أبطأ بكثير معدلات بالمقارنة مع الحلقات والمناطق المضطربة (وأحيانا لا على الإطلاق) 12. وهذا يسمح للتحليل البروتين العالمي، حيث الاضطرابات في بنية (على سبيل المثال، عند تجميع أو الركيزة ملزمة) تؤدي إلى اختلاف امتصاص الديوتيريوم (الشكل 1).
ويمكن إدراج خلاط الشعرية الحركية إلى منصة ميكروفلويديك تحتوي على غرفة بروتين لتوطين امتصاص الديوتيريوم. يقام هذه القاعة بروتين في انخفاض الرقم الهيدروجيني من أجل إخماد فعالية رد الفعل الصرف، ويتطلب البروتيني حامض يجمد من أجل هضم البروتين في الببتيدات المترجمة (الشكل 2). مراقبة الصرف العمود الفقري في ميلي ثانية واحدة لجداول زمنية ثانية مهم خاصة بالنسبة للتوصيف التغييرات بتكوين ضمن الصعب تميز المناطق حلقة، كريات المنصهرة، والبروتينات المختلين جوهريا (النازحين) 13، 14. بدلا من ذلك، يمكن TRESI-HDX أيضا أن تستخدم لتوصيف البروتينات أنه في الوقت الراهن ليس لدينا التركيب الذري حلها من خلال أساليب البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي، وذلك باستخدام الصرف الديوتريوم إلى جانب لخوارزمية COREX (DX-COREX) نهج 15 و 16. وهذا البروتوكول مفصل تنطبق TRESI-HDX لدراسة تاو، وهو IDP، في كل من انها شكل الأصلي، فضلا عن أنها دولة hyperphosphorylated المسببة للأمراض. بينما تاو الأصلي هو واحد من أكثر النازحين مدروسة، لا يعرف الكثير عن نظيره amyloidogenic 13 منه.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما الأساليب البيولوجيا البنيوية مثل البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي هي مفيدة لأنها توفر الهياكل مفصلة للغاية من البروتينات، وهذه الصور هي في كثير من الأحيان ثابتة. استمر توصيف الأنواع العابرة والمجالات المهيكلة ضعيف أن يكون بعيد المنال عند دراستها …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization?. Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development – A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
