عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير
Summary
تقدم هذه الورقة بروتوكول لمعالجة الصور البرد إم باستخدام مجموعة البرامج سفير. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على ما يقرب من جميع المشاريع إم الجسيمات واحد التي تستهدف قرار شبه الذرية.
Abstract
سفير (سباركس للالمجهر الإلكتروني عالية الدقة) هو رواية مفتوحة المصدر، مجموعة برامج سهلة الاستعمال لمعالجة شبه الآلي من الجسيمات الإلكترونية واحدة البرد المجهري (البرد إم) البيانات. بروتوكول المعروضة هنا يصف بالتفصيل كيفية الحصول على بنية قرار شبه الذرية بدءا من البرد ميك الصور المجهرية من خلال توجيه المستخدمين من خلال جميع الخطوات من خط أنابيب تحديد هيكل الجسيم واحد. يتم التحكم في هذه الخطوات من واجهة المستخدم الرسومية سفير الجديدة وتتطلب الحد الأدنى من تدخل المستخدم. باستخدام هذا البروتوكول ، وقد استمدت بنية Å 3.5 من TcdA1، مجمع تكس تس من لومينزنس فوتورهابدوس ، فقط من 9500 جزيئات واحدة. وهذا النهج مبسطة تساعد المستخدمين المبتدئين دون خبرة معالجة واسعة ومعلومات هيكلية مسبقة ، للحصول على نماذج ذرية خالية من الضوضاء وغير متحيز من المجمعات الجزيئات المنقى في حالتهم الأصلية.
Introduction
بعد تطوير التكنولوجيا الكاشف الإلكترون المباشر، والتقدم الملحوظ في الجسيمات واحد كريو-إم حاليا إعادة تشكيل البيولوجيا الهيكلية 1 . وبالمقارنة مع البلورات بالأشعة السينية، تتطلب هذه التقنية كمية صغيرة فقط من مادة البروتين دون الحاجة إلى التبلور، بينما تفرض في الوقت نفسه قيودا أقل فيما يتعلق بنقاء العينة، ولا تزال تسمح بتحديد الهياكل عند الحل شبه الذري. الأهم من ذلك، يمكن أن تكون تركيبات أو ولايات مختلفة الآن مفصولة حسابيا ويمكن تحديد هيكلية من مختلف التوافقات على مستوى غير مسبوق من التفاصيل. في الآونة الأخيرة، يمكن أن تنتج خرائط الكثافة من الجزيئات الصعبة في القرارات التي تسمح دي نوفو بناء نموذج، وبالتالي فهم عميق من طريقة عملها 2 ، 3 ، 4 ، 5.
تتوفر مجموعة واسعة من حزم برامج معالجة الصور في مجتمع 3DEM (3D إليكترون ميكروسكوبي) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) ومعظمها قيد التطوير المستمر. وقد تم التوصل إلى قرار شبه الذرية للبروتينات التي تظهر الأوزان الجزيئية المختلفة والتناظر مع العديد من حزم البرامج المختلفة، بما في ذلك EMAN2 6 ، إيماجيك 7 ، فريلين 8 ، ريليون 9 ، سبايدر 10 ، و سباركس 11 . وتتطلب كل حزمة مستوى مختلفا من خبرات المستعملين وتوفر مستوى مختلفا من توجيهات المستعملين والأتمتة والتمدد. وعلاوة على ذلك، في حين أن بعض البرامج توفر بيئات كاملة لتسهيل جميع خطوات تحليل الصور، فإن بعضها الآخر يهدف إلى تحسين المهام المحددة، مثل صقل معلمات المحاذاة بدءا من r المعروفةهيكل الإيجارات. وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير العديد من المنصات، بما في ذلك أبيون 12 و سسيبيون 13 ، التي توفر خط أنابيب معالجة واحد يدمج النهج والبروتوكولات من حزم البرامج المختلفة المذكورة أعلاه.
للمساهمة في التنمية الحالية من البرد إم، تم إعادة تطوير سباركس إلى منصة مستقلة جديدة وكاملة لتحليل الجسيمات واحد، ودعا سفير (سباركس للمجهر الإلكتروني عالية الدقة). من أجل زيادة إمكانية الوصول إلى هذه التقنية للباحثين الجدد في هذا المجال، ومعالجة كمية كبيرة من البيانات التي تنتجها المجاهر الإلكترونية الحديثة بالكامل الآلي الآلي، وإعادة تصميم خط الأنابيب وتبسيطها من خلال تقديم وسيلة سهلة الاستخدام واجهة المستخدم الرسومية (غوي) وأتمتة الخطوات الرئيسية لسير العمل. وعلاوة على ذلك، تم إضافة خوارزميات جديدة للسماح سريع، استنساخه وتحديد الآلية الآلي من كريو-إم الصور. وعلاوة على ذلك، تم إدخال التحقق من قبل استنساخه من أجل تجنب القطع الأثرية المشتركة المنتجة خلال تحسين والتحليل عدم التجانس.
وعلى الرغم من أن البرنامج قد تم تعديله على نطاق واسع، فقد تم الإبقاء على سماته الأساسية المقدرة: شفرة المصدر المفتوح المباشرة، والتصميم الحديث الموجه نحو الأشياء، واجهات بايثون لجميع الوظائف الأساسية. وبالتالي، لم يتغير إلى برنامج الصندوق الأسود، مما يتيح للمستخدمين دراسة وسهولة تعديل رمز بايثون، لإنشاء تطبيقات إضافية أو تعديل سير العمل العام. وهذا مفيد بشكل خاص للمشاريع غير القياسية البرد إم.
هنا نقدم بروتوكول للحصول على خريطة كثافة القرار الذري القريب من الصور البرد إم باستخدام واجهة المستخدم الرسومية من سفير. وهو يصف بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوليد خريطة الكثافة من الخام البرد إم الأفلام كاشف المباشر ولا يقتصر على أي نوع جزيء معين. ويهدف هذا البروتوكول في المقام الأول لتوجيه نيوكيخدش في الميدان من خلال سير العمل وتقديم معلومات هامة حول الخطوات الحاسمة من تجهيز فضلا عن بعض المزالق والعقبات المحتملة. وسيتم وصف المزيد من الميزات المتقدمة والخلفية النظرية وراء سفير في مكان آخر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت الجسيمات واحد البرد- إم التطور السريع في السنوات الأخيرة، وسلمت العديد من هياكل القرار الذرية من المجمعات الجزيئية ذات الأهمية البيولوجية الكبرى 25 . من أجل دعم عدد كبير من المستخدمين المبتدئين الذين يدخلون حاليا الحقل، قمنا بتطوير منصة تحليل صورة الجسيمات واحد سفير وتقديم هنا من خلال بروتوكول المشي من خلال سير العمل بأكمله بما في ذلك محاذاة الفيلم، واختيار الجسيمات، تقدير كتف، النموذج الأولي حساب، 2D و 3D تحليل عدم التجانس، عالية الدقة 3D صقل وتقدير القرار المحلي والتصفية.
ويهدف البروتوكول الموصوفة هنا كدليل قصير لتحديد هيكل 3D باستخدام ميكروغرافس البرد إم من البروتين من الفائدة وبمساعدة من الأدوات الحسابية التي تقدمها واجهة المستخدم الرسومية المستقلة من سفير.
السمة الرئيسية لسير العمل هو أن معظممن الإجراءات تحتاج إلى تشغيل مرة واحدة فقط، لأنها تعتمد على مفهوم التحقق من صحة من قبل استنساخ 19 ولا تتطلب المعلمة التغيير والتبديل. هذه الآلية التلقائية للتحقق من الصحة هي الميزة الرئيسية ل سفير على حزم البرامج الأخرى منذ النتائج تميل إلى أن تكون موضوعية وكذلك استنساخه، والأهم من ذلك، يمكن الحصول عليها بتكلفة حسابية مقبولة. ويوفر خط الأنابيب بالإضافة إلى ذلك ثروة من المعلومات التشخيصية للمستخدمين ذوي الخبرة لإجراء مزيد من التحقق المستقل والتقييم مع الأساليب الخاصة. ومع ذلك، يجب أن يكون المستخدم المبتدئ الذي لديه على الأقل الخلفية النظرية عنصري في علم الأحياء الهيكلي والمجهر الإلكتروني قادرة على الحصول على هياكل قرار شبه الذرية باستخدام البيانات الخاصة وإجراءات التحقق الآلي.
ومع ذلك، فإن الحصول على بنية قرار شبه الذرية ليست دائما واضحة وسوف تعتمد النتيجة إلى حد كبير على نوعية العينة ودات المدخلاتا. وفيما يتعلق بالإجراءات المعروضة هنا، يفترض أن عددا كافيا من أفلام إم الخام غير المحاذاة عالية الجودة متوافرة، مع أن متوسطاتها تظهر جسيمات مفردة متجانسة ومميزة بشكل عشوائي. بشكل عام، لا توجد قيود على التماثل أو الحجم أو الشكل العام للجزيء، ولكن الوزن الجزيئي المنخفض يمكن أن يكون عاملا محددا، خاصة عندما يكون للبروتين شكل كروي بدون سمات. وعادة ما يكون تحليل الجسيمات الأكبر حجما والمرتبة جيدا مع التماثل العالي بين النقاط أقل تطلبا. ولذلك، فمن المستحسن للمستخدمين المبتدئين لتشغيل البروتوكول الحالي لأول مرة مع مجموعة بيانات كريو-إم جيدا. إما البيانات التعليمية سفير (هتب: /sphire.mpg.de) أو واحدة من إمبيار مجموعات البيانات المقدمة (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) مع الأفلام الخام هي نقطة انطلاق جيدة .
عند معالجة البيانات الخاصة، فمن المرجح جدا أن بعض مجموعات البيانات أو بعض الصور لن يرضي بعض كواليتي. في هذا السياق، بالإضافة إلى الشيكات الاستقرار الآلي والتكاثر، التي يؤديها البرنامج للخطوات الرئيسية لسير العمل، فإنه لا يزال يوصي للمستخدمين لفحص بصريا النتائج في بعض "نقاط التفتيش" من البروتوكول، وخاصة إذا كان إعادة الإعمار النهائي ليست مرضية.
يمكن إجراء الفحص البصري الأول على مستوى ميكروغراف بعد محاذاة الفيلم ( بروتوكول الخطوة 2 ) وتقدير كتف ( بروتوكول الخطوة 3 ). وينبغي أن تظهر المعدلات المصححة الناتجة عن الحركة جسيمات مفردة واضحة المعالم وذات فصل جيد، وينبغي أن تظهر أطياف الطاقة الخاصة بها حلقات ثون واضحة ومتنوعة. ويعرف التردد المكاني الذي تكون فيه مرئية، في معظم الحالات، أعلى درجة يمكن أن يحددها الهيكل من حيث المبدأ في نهاية المطاف. وترد أمثلة لمتوسط تصحيح الحركة من نوعية كافية وطيف الطاقة في القسم & #34؛ نتائج الممثل "، ويمكن إزالة الصور الخارجة التي قد يكون لها تأثير سلبي على النتيجة النهائية بمساعدة سفير الانجراف و كتف تقييم أدوات واجهة المستخدم الرسومية (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
وفيما يتعلق بفحص الجسيمات، فإن الخطوة الحاسمة في خط أنابيب سفير هي التصنيف 2D باستخدام إيساك ( بروتوكول الخطوة 5.2) . هنا، يجب على المستخدم التحكم في أن المتوسطات الطبقة 2D استنساخه التي يتم تحديدها تلقائيا من قبل البرنامج تعتمد مجموعة من التوجهات كافية لتغطية شبه بالتساوي الفضاء الزاوي. إذا كانت جودة المتوسطات الصفية غير مرضية (صاخبة و / أو صور ضبابية) و / أو عدد متوسطات الطبقة القابلة للتكرار منخفضة جدا، فكر في تحسين جودة التقاط السيارات، وتحسين تصوير مجموعة البيانات أو إعداد العينات. في معظم الحالات، لا يمكن حساب إعادة بناء موثوق بها من مجموعة بيانات لا تعطي متوسطات جيدة للصف الثاني. أمثلة على جودة عالية 2D الطبقة أفيتظهر في القسم "نتائج الممثل".
مطلوب ما لا يقل عن 100 المتوسطات الطبقة للحصول على نموذج 3D الأولي موثوق بها باستخدام رفيبر بطريقة تلقائية ( بروتوكول الخطوة 6.1 ). لهذه الخطوة، يجب على المستخدم تحديد المتوسطات بأعلى مستويات الجودة وتشمل العديد من التوجهات المختلفة للجسيمات ممكن. جودة النموذج الأولي أمر بالغ الأهمية لنجاح اللاحقة عالية الدقة 3D صقل.
في حزم البرمجيات الأخرى، يتم تنفيذ تصنيف 3D أحيانا لإزالة جزيئات "سيئة" 8 ، 9 . ومع ذلك، في سفير معظم هذه الجسيمات تلقائيا القضاء بالفعل خلال تصنيف 2D باستخدام إيساك. وبالتالي، فمن المستحسن لأداء خطوة مكثفة حسابيا من 3D الفرز إلا إذا كان إعادة الإعمار وتحليل التباين 3D تشير إلى عدم التجانس من مجموعة البيانات.
الأهم من ذلك، يجب على المستخدم دائما فحص بعناية أحجام 3D الناتجة بعناية ( بروتوكول الخطوة 9.3 )، وتؤكد أن ملامح كثافة منها تتفق بشكل جيد مع القرار الاسمي. في قرار من <9 Å، وكثافات تشبه قضيب المقابلة α-هيليسس تصبح مرئية. في قرار <4.5 Å، الكثافات المقابلة للخيوط في β-صحائف عادة ما تكون منفصلة بشكل جيد والأحماض الأمينية ضخمة تصبح مرئية. يجب أن تظهر خريطة عالية الدقة (<3 Å) سلاسل جانبية واضحة المعالم، مما يسمح ببناء نموذج ذري دقيق.
النتائج التي تم الحصول عليها حتى الآن تبين أنه، بمساعدة الاختبارات استنساخ الآلي سفير والحد الأدنى من عمليات التفتيش البصرية، والبروتوكول الحالي ينطبق عموما على أي نوع من الجسيمات واحد مشروع البرد إم. يتم عرض نتائج ممثل كل خطوة معالجة لإعادة إعمار TCDA1 السمفوتورهابدوس لومينزنس 21 ، والتي تم حلها إلى قرار شبه الذرية. ويمكن استخدام خرائط الكثافة ذات النوعية المتشابهة لبناء نماذج ذرية موثوقة من خلال تعقب العمود الفقري دي نوفو ، فضلا عن الصقل المتبادل أو الفضاء الحقيقي، وبالتالي توفير إطار هيكلي متين لفهم الآليات الجزيئية المعقدة.
أكسيون كوديس:
الإحداثيات لهيكل إم والأفلام غير المجهزة قد أودعت في البنك بيانات المجهر الإلكتروني والميكروسكوب التجريبي صورة أرشيف تحت أرقام الانضمام إمد-3645 و إمبيار-10089، على التوالي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر D. روديرر ل تزويدنا TcdA1 ميكروغرافس. نشكر ستيف لودتك على دعمه المستمر للبنية التحتية EMAN2. وأيد هذا العمل أموال من جمعية ماكس بلانك (إلى ريال) والمجلس الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7 / 2007-2013) (منحة رقم 615984) (إلى ريال) ومنحة من المعاهد الوطنية الصحة R01 GM60635 إلى باب).
Materials
| SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
| Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
| Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
| TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
| Falcon II direct electron detector | FEI | ||
| EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |
References
- Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Bai, X. -. C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
- Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
- von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
- Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
- Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
- Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
- Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
- Frank, J. . Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).
- Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
- Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
- Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
- Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
- Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
- Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).
