SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

注記：このプロトコルに従うには、SPIREをMPIがインストールされているシステム（現在はLinuxクラスタ）に正しくインストールする必要があります。 http://www.sphire.mpg.deからSPHIREとTcdA1データセットをダウンロードし、インストール手順に従ってください：http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download。この手順では、EMAN2もインストールされます。 SPHIREは、パーティクルの選択にはEMAN2のe2boxerを使用し、画像ファイルの表示にはe2displayを使用しています。生の顕微鏡写真ムービーの線量加重モーション補正のために、SPHIREは非ぼかし14を使用します。プログラムをダウンロードし、インストール手順に従ってください（http://grigoriefflab.janelia.org/unblur、Grigorieff lab）。得られた構造の対話的視覚化のために、プロトコルは分子グラフィックスプログラムであるChimera 15 （https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html）を使用する。このプロトコル全体で使用されている機能に精通している素敵なチュートリアルは、こちら：https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html。 SPHIRE GUIからクラスタに並列ジョブを送信する方法については、http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissionsを参照してください。 SPHIRE GUIの全体的な構成と、このプロトコル全体で実行されるワークフローの主なステップを図1に示します。 1. PROJECT：このプロジェクトの定数パラメータ値を設定するターミナルウィンドウで " sphire＆"とENTERキーを押してSPIRE GUIアプリケーションを起動します。 プロジェクト設定ページの各入力フィールドで、プロジェクト全体のパラメータ（ピクセルサイズ、パーティクル半径、対称性など）を調整し、これらの値をワークフローのすべての後続ステップに登録します。 左側のパネルの右下にある "PROJECT"アイコンをクリックして、プロジェクト設定ページを開きます。 <li> e2display.pyイメージインタラクティブディスプレイツールを使用してパーティクルの最長軸を測定し、「Protein particle radius」にパーティクルサイズの半分を入力します。測定値がÅの場合は、ピクセルサイズを使用して単位をピクセルに変換することに注意してください（ たとえば、パーティクルの長さが200Å、ピクセルサイズが1.2Å/ピクセルの場合、パーティクルの最長軸は200 / 1.2 =〜166ピクセル、半径166/2 = 83ピクセル）。 「パーティクルボックスサイズ」をパーティクルサイズの1.5倍以上に設定します。大きな素数を含むウィンドウサイズは使用しないでください。また、3D精緻化アルゴリズムは現在、偶数番号のボックスサイズを必要とすることに注意してください。 注：ウィンドウには、適切なCTF補正のためにピッキング（ウィンドウ内のパーティクルの移動の必要性）とパーティクル境界の外側の十分な背景領域に起因する初期センタリング誤差を考慮するマージンが含まれている必要があります（特に大きなデフォーカス値<sup class = "xref"> 16）。 「CTFウィンドウサイズ」を「パーティクルボックスサイズ」に設定します。コントラストの低いデータのプロジェクトの場合は、より大きなウィンドウを使用して、パワースペクトルのスムーズな推定値を取得します。 複合体（ 例えば、 "C5"）の "点群対称性"を設定する。ターゲット構造の対称性がわからない場合は、 "C1"（非対称）のままにします。ただし、後で特定の高次対称性が処理中に特定された場合は、この対称性の設定を適宜変更し、ISACとの2Dアラインメント後の手順を繰り返します。 kDaで "Protein molecular mass"を設定します（おおよその値で十分です）。 "Register settings"ボタンを押してください。 2.ムービー：各ムービーマイクログラフのフレームを調整してサンプルの全体的な動きを補正する すべてのムービー顕微鏡写真について、すべてのフレームのx / yシフトを計算してから、その線量 – 重み付けされていない線量 – 加重平均を作成する（討議参照）。前者は、CTF推定のためにのみ必要であることに留意されたい。なぜなら、推定は用量加重平均では良好に機能しないが、後者は構造決定の他のすべてのステップに使用されるからである。 「MOVIE」アイコンをクリックし、「Micrograph Movie Alignment」ボタンをクリックします。実行ファイルを選択して、「実行可能ファイルのパスを解除する」を設定します。アライメントされていない生の顕微鏡写真を選択し、ファイル名の可変部分をワイルドカード "*"（ 例えば、 TcdA1 _ *。mrc）で置き換えることによって、 "入力顕微鏡写真パスパターン"を設定します。 「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 実行可能ファイルを選択して、 "Summovie executable path"を設定します。 「ムービーフレーム数」を各ムービー顕微鏡写真のフレーム数に設定します。 「顕微鏡の電圧」と「フレームごとの露出」をデータ収集中の値に設定します。 （例としてすべてのフレームの露光量は60/20 = 3 e – / A 2です。） "Run Command"ボタンを押して、各ムービー顕微鏡写真のフレーム。 注：これにより、 線量 – 重み付けされていない線量加重平均補正された平均顕微鏡写真をそれぞれ含む2つの出力ディレクトリが自動的に作成されます。 3. CTER：CTFのデフォーカスと乱視のパラメータを推定する 各線量 – 重み付けされていない平均顕微鏡写真について、CTFパラメータ（デフォーカスおよび非点収差;ユーザによって設定されるもの）を推定する。 "CTER"アイコンをクリックし、次に "CTF Estimation"ボタンをクリックします。 「入力顕微鏡写真パスパターン」を設定するには、線量 – 重み付けされていない動き補正された顕微鏡写真を選択し、ファイル名の可変部分をワイルドカード"*"。また、「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 実験室におけるデータの種類（氷の厚さが主要因）と顕微鏡の電圧（ 例えば 10％）に日常的に使用される値に「振幅コントラスト」を設定します。典型的な値は7〜14％の範囲です17 。 データ収集中に使用される「顕微鏡の球面収差（Cs）」および「顕微鏡の電圧」を設定します。 CTFモデルフィッティングの検索範囲の "最低周波数"と "最高周波数"をそれぞれ0.0285と0.285Å -1 （40 – 4Å）に設定します。 CTFパラメータを推定するには、 "Run command"ボタンを押してください。 注記：CTFパラメータは、指定した出力ディレクトリのpartres.txtファイルに自動的に保存されます。 112枚の顕微鏡写真のCTF推定値を96個のコアで計算し、代表的な結果を得るために使用したLinuxクラスタで約3分後に終了した。 4.ウィンドウ：線量加重平均顕微鏡写真から粒子を抽出する e2boxer 6で顕微鏡写真から手動または自動で粒子を選択し、それぞれに関連する顕微鏡写真内の粒子xy座標のリストを含む座標ファイルを作成します。 "WINDOW"アイコンをクリックし、次に "Particle Picking"ボタンをクリックします。 "Run command"ボタンを押してe2boxer 6を起動し、各顕微鏡写真の粒子を手動または自動で選択します。18 （ 討議を参照）。各顕微鏡写真の最終粒子座標をEMAN1ファイル形式（.box）で保存します。または、座標ファイルをEMAN1形式に変換した後、他のプログラムからインポートすることもできます。 線量加重顕微鏡写真から粒子画像を抽出して粒子スタックを作成します（SPHIREでは、粒子スタックはありません）単に「スタック」と呼ばれる）。 「Particle Extraction」ボタンを押します。 線量加重の動き補正された顕微鏡写真を選択し、ファイル名の可変部分をワイルドカード "*"（ 例えば、 TcdA1 _ *。mrc）で置き換えることによって、 "入力顕微鏡写真パスパターン"を指定してください。同様に、座標ファイル（ 例： TcdA1 _ *。ボックス）を選択して、 "座標入力パスパターン"を設定します。 「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 CTFパラメータファイル（手順3.1で作成したpartres.txt）を選択して、 "CTF parameters source"を設定します。 "Run command"ボタンを押してください。 抽出された粒子画像スタックを単一の画像スタックに結合する。 「パーティクルスタック」ボタンをクリックします。 BDBファイルパス形式（ 例 ： "bdb：Particles / stack"、ここで "Particles"はthを指す）を使用して、 "Output virtual image stack"へのパスを指定しますeディレクトリにはBDBデータベース・ディレクトリがあり、その名前は常にEMAN2DBであり、「スタック」はこのデータベース内の特定のイメージ・スタックを指します。 "mpi_proc"で始まるディレクトリを選択し、ディレクトリ名の可変部分をワイルドカード "*"（ 例えば Particles / mpi_proc_000〜Particles / mpi_proc_ *）に置き換えることによって、 "Input BDB image stack pattern"を指定します。 "Run command"ボタンを押してください。 5. ISAC：2Dにおけるパーティクル画像の分類 パーティクルを整列させ、2D外観に基づいてパーティクルをクラスタリングすることによって、2Dクラスの平均を計算します。 注：結果として生じる2D平均は、個々の粒子画像と比較して改善された信号対雑音比（SNR）を有し、したがって、データセットの品質および異種性を視覚的に評価し、望ましくない画像をスタックから選別するために使用される（ 例えば、氷晶、炭素エッジ、骨材、破片など ） 19 。さらに、それらはその後、最初の3Dモデルを決定するために使用される。 "ISAC"アイコンをクリックし、次に "ISAC – 2D Clustering"ボタンをクリックします。抽出されたパーティクルを含むスタックファイルを選択して、 "Input image stack"を設定します。 「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 「クラスごとの画像」には200〜1000を使用します。予想される2Dクラス数（1クラスあたりの画像数で割った合計粒子数）を考慮して、適切な数を選択します。このパラメータは、SNRとデータセットのサイズに応じて調整します。データセットが過度にノイズが多い場合は、クラスごとのメンバー数を増やします。少ない数のパーティクルが使用可能な場合は、数を減らしてください。 注記：メモリの制約から、大規模なデータセット（> 100,000個のパーティクル）では、完全なデータセットをサブセットに分割し、各サブセットごとにISACを独立して実行し、結合します最後の結果。この処理シナリオの詳細な手順は、http：//www.sphire.mpg.de/wiki/doku.phpに記載されています。 「Phase-flip」チェックボックスをオンにします。 「Target particle radius」と「Target particle image size」のデフォルト値は、これらの設定ですべてのパーティクルイメージを自動的に縮小することで処理速度を上げてください。 "Run command"ボタンを押して、2Dクラスの平均を計算します。 注：このステップは計算的に要求され、粒子やクラスの数、ターゲットの半径と画像のサイズとともに、実行時間が大幅に増加します。 96個のプロセスを含むクラスタでは、10,000個の粒子の2D分類が約90分後に終了しました。 結果として得られるISAC 2Dの平均値を表示し、視覚的に検査して、品質が満足できるものであることを確認します（ディスカッション参照）。 「UTILITIES」の下の「Display Data」ボタンを押します。セット ";入力ファイル "を選択し、ISAC 2D平均値を含むファイル（ステップ5.1で作成したclass_averages.hdf）を選択します。 検証されたクラス平均のパーティクルメンバーだけを含む新しいスタックを作成します。 "Create Stack Subset"ボタンを押します。手順5.1.1と同じスタックファイルを選択して、「画像入力スタック」を設定します。 ISAC 2D平均（ステップ5.1で作成したclass_averages.hdf）を選択して、「ISAC平均」を設定します。 「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 "Run command"ボタンを押してください。 6. VIPER：初期3Dモデルの計算 すべての不良クラスの平均とパーティクルの同一ビューを削除して（ディスカッション参照）、クラス平均（100以上の画像）の小さなセットを選択し、それらを使用して担当者を計算しますVIPERを用​​いた誘導可能な初期モデル。選択には、それぞれ200〜500人のメンバーで、少なくとも60〜80の高品質平均を含める必要があることを忘れないでください。 「VIPER」アイコンをクリックし、次に「データ表示」ボタンをクリックします。 ISAC 2D平均（ステップ5.1で作成したclass_averages.hdf）を選択して、「入力ファイル」を設定します。 "Run command"ボタンを押してください。 e2displayのグラフィックウィンドウのどこかにあるマウスの中央ボタンを押し、ポップアップウィンドウで "DEL"ボタンを押してください。すべての不良クラスの平均値と、パーティクルの同じビューを削除します（ ディスカッション参照）。残りの2Dクラスの平均を新しいファイルに保存するには、[保存]ボタンを押します。 選択されたISAC平均値から、後続の3Dリファインメントの初期参照を生成します。 「初期3Dモデル – RVIPER」ボタンをクリックします。スクリーニングされたクラスを選択して「入力画像のスタック」を設定する平均値（ステップ6.1で生成）。 「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 ISACのステップ5.1.3と同じ目標粒子半径を使用してください。 "Run command"ボタンを押すと、再現可能なab initio 3Dモデルが生成されます。 注：このステップは計算的に要求され、実行時間は粒子の平均数とサイズの数によって大幅に増加します。 96プロセスのクラスタでは、このジョブ（〜100クラスの平均）は〜15分後に終了しました。 結果として得られた3Dモデルが、クラス平均と構造的完全性（ すなわち 、切断された部品および/または方向性のアーティファクト）を考慮に入れて合理的であるかどうかをチェックする。マップを表示するには、プログラムChimera 15を使用します。この時点で、相同タンパク質の結晶構造または目的タンパク質のドメインとの最初の比較を行う（例はReprese結果）。 後続の3D精細化のためには、周囲のノイズを除去し、元のピクセルサイズに一致するように再スケーリングすることによって、初期3D基準と3Dマスクからab initio 3Dモデルを生成する。 "Create 3D Reference"ボタンをクリックします。 ab initio 3Dモデル（ステップ6.2で作成したaverage_volume.hdf）を選択して、「Input volume」を設定します。 「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 ISAC縮小率ファイル（手順5.1で作成したREADME_shrink_ratio.txt）を選択して、 "Resample ratio source"を設定します。 "Run command"ボタンを押してください。 メリディアン：最初の3Dボリュームを精密化する 最初の3Dモデルから3Dボリュームを再調整します。 "MERIDIEN"アイコンをクリックし、次に "3D Refinement"ボタンをクリックします。 seleで「画像入力スタック」と「初期3D参照」を設定する粒子スタックおよびab initio 3Dモデル（それぞれステップ5.3および6.4で生成された）を用いて計算する。 「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 ステップ6.4で作成した3Dマスクファイルを選択して、「3Dマスク」を設定します。常に3Dマスクを使用しますが、特に分析の初期段階では、誤ったマスキングの偏りを避けるために、リファレンスに緩くフィットする球面マスクまたはソフトエッジマスクを使用してください。 [ハード2Dマスクを適用する]チェックボックスをオンにします。 「開始解像度」を20〜25Åのカットオフ周波数値に設定します。このカットオフ周波数を持つローパスフィルタは、最初の3D構造に適用され、初期モデルバイアスを低減することに注意してください。 このプロセスで使用するクラスタの仕様を確認し、「ノードごとのメモリ」を使用可能なメモリ（ギガバイト）に設定します。 「実行コマンド」ボタンを押すと、最初の3Dモデルから始まる3Dボリュームを完全に自動化された方法で絞り込むことができます。 <br />注記：この手順では、データセットを2つの半分に分割し、2つのモデルを個別に調整し、2つのrawボリュームを出力します。それは計算的に要求され、実行時間は粒子の数と共に著しく増加する。このクラスターでは、192プロセス（約8,000粒子、352ボックスサイズ）で約2.5時間実行した後に子午線細分化が終了しました。 次の鮮明化ステップのために、洗練されたボリュームからソフトエッジの3Dマスクを作成します。 「アダプティブ3Dマスク」ボタンをクリックします。フィルタリングされていない半音量（ステップ7.1で作成）の1つを選択して、「入力音量」を設定します。 「出力マスク」のパスを指定します。 「二値化しきい値」の値を設定します。キメラを使用して、この特定の閾値で、ノイズがフィルタリングされていないハーフマップの溶媒領域の関心ボリュームの外にあることを確認します。タンパク質のすべての密度はまだcです相互に接続されている。ソフトエッジ3Dマスクを作成するには、「コマンドを実行」ボタンを押します。 注：得られたマスクの本体（値が> 0.5であるボクセルからなる）は、粒子構造にしっかりと適合しなければならないが、依然として関心のあるすべての密度を囲む。ソフトエッジの減衰は、少なくとも8-10ピクセル幅である必要があります。 3Dリファインメントで得られた2つのフィルタリングされていない半ボリュームをマージします。次に、検出器の変調伝達関数（MTF）、推定B係数、および分解能のFSC（フーリエ・シェル相関）推定に基づいて、パワースペクトルを調整することによって、併合されたボリュームをシャープにします。 「鮮明化」ボタンを選択します。手順7.1で作成した対応するファイル（vol_0_unfil.hdfおよびvol_1_unfil.hdf）を選択して、「最初のフィルタリングされていないハーフボリューム」および「2番目のフィルタリングされていないハーフボリューム」を設定します。常に「B因子強化」を使用してください。通常は、デフォルト値をそのままにしておく最終分解能周波数と10Åの間の範囲を使用して、入力データセットからBファクタ値を推測します。または、 アドホック値（ たとえば、 -100）を指定します。 FSCベースのフィルタを適用するには、「ローパスフィルタ周波数」のデフォルト値を維持します。 3Dマスク（手順7.2で作成）を選択して、「ユーザー提供のマスク」を設定します。報告された解像度は、このマスクでFSCを使用して決定されることに注意してください。 "実行コマンド"ボタンを押して、洗練された3Dボリュームをシャープにします。 上の3D精密化ステップで推定されたすべてのパーティクルの投影方向から3D角度分布マップを生成します。 「角度分布」ボタンをクリックします。手順7.1で作成したファイル（final_params.txt）を選択して "Alignment parameter file"を設定し、 "Run command"ボタンを押します。 Chiを使用して鮮明な3Dモデルを視覚的に検査するメラ。達成された解決策を考慮して構造が合理的に見えることを確認する（ 討議を参照）。 キメラを用いて角度分布を目視検査する。ディストリビューションが3D角空間全体をほぼ均等にカバーしていることを確認します。対称構造の場合、分布は固有の非対称三角形内に制限されることに留意してください。 8. SORT3D：高度に可変な領域に焦点を当てて3D異種性をソートする 3Dリファインメントで使用されるパーティクルスタックから3D可変性マップを計算します。 「SORT3D」アイコンをクリックし、次に「3D Variability Estimation」ボタンをクリックします。 3Dリファインメント・ステップ7.1.1に与えられたものと同じスクリーン・パーティクル・スタックを選択して、 "Input image stack"を設定します。 「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 「投影数」のデフォルト値を維持します。 注：角度の隣からの画像フードは、各3D投影角度での2D分散を推定するために使用される。数値が大きいほど、推定値のノイズは少なくなりますが、解像度と回転アーチファクトはより低くなります。 [Use CTF]チェックボックスをオンにします。 "Run command"ボタンを押してください。 3D変動マップを使用して、以下の3Dクラスタリングステップのフォーカスマスクを作成します。 「バイナリ3Dマスク」ボタンを選択します。 3D可変性マップ（ステップ8.1で作成）を選択して、「入力ボリューム」を設定します。 「出力マスク」のファイルパスを指定します。 キメラの "Volume Viewer"の "Level"フィールドの出力を使用して、 "Binarization threshold"を設定します。 "Run command"ボタンを押してください。 構造的に非常に可変な領域に焦点を当て、粒子画像を均質な構造グループに分類します。 "3D Clustering – RSORT3D"ボタンを押してください。3Dリファインメント（ステップ7.1で作成）の出力ディレクトリを選択して、 "Input 3D refinement directory"を設定します。 「出力ディレクトリ」のパスを指定します。 ソフトエッジ3Dマスク（手順7.2で作成）を選択して、「3Dマスク」を設定します。二値化された3D可変性マップ（ステップ8.2で生成）を選択して、 "Focus 3D mask"を設定します。 大規模なデータセットの場合は、「1グループあたりの画像数」に少なくとも5,000〜10,000を使用します。プログラムは、この設定よりもグループあたりの画像数を常に低く保つことを覚えておいてください。予想される3Dグループの数（粒子の総数を「グループあたりの画像数」で割った値）、データセット、SNR、異質度を考慮して値を調整します。データセット内の別個の構造状態の数がより多くなることが予想されない限り、十分な数の粒子が利用可能である場合には、〜5-10の初期3Dグループから開始する。 「最小のグループサイズ」には少なくとも3,000〜5,000個の粒子を使用します。プログラムは、「最小グループサイズ」の設定よりも少ない数の画像を含むグループを無視することに注意してください。 "Run command"ボタンを押して、3Dクラスタリングを実行します。 注：RSORT3Dは2つのステップに細分されています。最初の "sort3d"ステップは、3D異質性をソートします。次に、上の3D精密化ステップによって決定された3Dアラインメントパラメータを使用して、各均質構造グループのボリュームを再構築する。第2の "rsort3d"ステップは、2つの独立したソーティング実行の双方向比較を実行することによって、各グループの再現可能なメンバーを見つける。次に、再現可能に割り当てられた粒子のみを使用して均質構造を再構成する。 96コアのクラスタでは、約3時間後にこのジョブ（約8,000パーティクル、352ボックスサイズ）が終了しました。 プログラムが終了したら、キメラを使用して同質の3Dグループを選択します。見た目の最も高い解像度の構造を選択します。典型的には最も高い解像度に関連付けられますパルグループ。興味のあるタンパク質の2Dクラスの平均と生物学的側面を考慮に入れて、選択した構造が視覚的に合理的であることを確認します（ ディスカッション参照）。同様の解像度でほぼ同一の構造を持つ他のボリュームがある場合、それらを単一の同質の3Dグループから出てくるものと見なしてください。 最も均質な3Dグループのパーティクルメンバーに対して（最高の解像度で）局所的な細分化を実行します。 "Local Subset Refinement"ボタンをクリックしてください。選択したグループのパーティクルIDを含むテキストファイル（ たとえば、手順8.3で作成したCluster0.txt）を選択して、[サブセットのテキストファイルパス]を設定します。前の3Dリファインメント（ステップ7.1で作成）の出力ディレクトリを選択して、「3Dリファインメントディレクトリ」を設定します。 以前の3Dリファインメントで最も高い解像度が達成されたものに "Restarting iteration"を設定します。プレス「コマンド実行」ボタンをクリックして、選択した粒子の集団を局所的に精緻化します。 ステップ7.2と同様に、ローカルサブセットリファインメントによって再構成されたフィルタリングされていない最後の半ボリュームからソフトエッジ3Dマスクを作成します。 ステップ7.3と同様に、ローカルサブセットリファインメントによって導出されたフィルタリングされていない2つの最終半ボリュームをマージし、マージされたボリュームをシャープにします。ただし、今回は鋭利なボリュームをフィルタリングしないでください。 注記：ステップ8.4の異質性分析が、同等の分解能でいくつかの異なる状態を示している場合は、すべての異なる状態を個別に洗練したい場合があります。 9. LOCALRES：最終3Dボリュームのローカル解像度を見積もる 均質な粒子群から得られた3Dボリュームの局所分解能を推定する。 "LOCALRES"アイコンをクリックし、次に "Local Resolution"ボタンをクリックします。 「最初の半音量」と「後半音量ステップ8.6で作成したソフトエッジの3Dマスクを選択して "3Dマスク"を設定し、 "出力ボリューム"のファイルパスを指定して、 。 "FSC window size"のデフォルト値は7ピクセルです。この設定は、ローカル – 実空間相関が計算されるウィンドウのサイズを定義することを忘れないでください。より大きなウィンドウサイズは、局所分解能を犠牲にしてより滑らかな解像度マップを生成する。 分解能基準には、 "Resolution cut-off"のデフォルト値の0.5を維持してください。 注：各ボクセルについて、プログラムはローカルFSCが選択された解像度閾値を下回る頻度としてローカル解像度を報告します。低い相関値は統計的な不確実性が高いため、0.5より低いしきい値は推奨しません。したがって、対応するローカル解像度は、ボクセル間で強く変化する。 「オーバー「解像度」を選択すると、ローカルサブセットリファインメント後のシャープニングで推定される絶対解像度が設定されます（ステップ8.7）。「コマンドを実行」ボタンを押してボリュームのローカル解像度を計算します。 3Dローカル解像度マップを使用して、ローカルサブセットリファインメント後にシャープにされたボリュームに3Dローカルフィルタを適用します。 「3Dローカルフィルタ」ボタンをクリックします。鮮明でフィルタリングされていない3Dボリューム（ステップ8.7で作成）を選択して、「入力ボリューム」を設定します。同様に、「ローカル解像度ファイル」と「3Dマスク」（それぞれステップ9.1と8.6で作成）を設定します。 3Dマスクは、ローカルフィルタリングが適用される領域を定義することに注意してください。 「出力ボリューム」のファイルパスを指定します。 "Run command"ボタンを押して、3Dローカルフィルタを適用します。 キメラを使用して、最終的な3Dモデルと3Dローカル解像度マップ（ステップ9,2と9.1で生成されたresp積極的に）。 「地色」オプションを選択すると、ローカル解像度に応じて3D音量が調整されます。地方の決議の配布はスムーズでなければならないことに留意してください（ 討議を参照）。