Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresan Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, nörobilim ve nörofarmakoloji araştırmalarında in vitro bir model olarak kullanılan birincil nöronal kültür olan kültürlenmiş serebellar granül nöronlarında Fluorescein diasetat (FDA) ve Propidyum İyodür (PI) çift boyasını kullanarak nöronal canlılığı nasıl doğru bir şekilde ölçtüğümü açıklamaktadır.
Abstract
Primer kültürlü Serebellar Granül Nöronları (CGN'ler) sinirbilimi ve nörofarmakoloji araştırmalarında in vitro bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, CGN kültüründe glial hücrelerin ve nöronların bir arada bulunması, nöronal canlılığın doğru bir şekilde değerlendirilmesinde önyargılara neden olabilir. Flöresein diasetat (FDA) ve Propidium Iodide (PI) çift boyama, canlı ve ölü hücreleri aynı anda değerlendirerek hücre yaşayabilirliğini ölçmek için kullanılmıştır. Kolorimetrik deneylerin duyarlılıklarını arttırmak ve CGN'lerde nöronal canlılığı değerlendirmek için FDA-PI çift boyamayı kullandık. Ayrıca, doğruluğunu artırmak için mavi floresan DNA lekelerini ( örn. Hoechst) ekledik. Bu protokol, CGN kültüründe bu yöntemleri kullanarak nöronal canlılığın değerlendirilmesinin doğruluğunu nasıl geliştireceğini açıklar. Bu protokolü kullanarak, glial hücrelerin sayısı floresan mikroskopisi kullanılarak çıkarılabilir. Benzer bir strateji istenmeyen gliyi ayırt etmek için de uygulanabilirÇeşitli hücrelerde, örneğin birincil kortikal kültür ve hipokampal kültürdeki nöronlardan hücreler.
Introduction
3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolyum bromür (MTT) tahlili gibi kolorimetrik sitotoksiklik testleri , hücre canlılığını in vitro olarak ölçmek için yaygın olarak kullanılır. Sıçanlardan alınan primer kültüre edilmiş Serebellar Granül Nöronları (CGN'ler) 1-metil-4-fenilpiridinyum iyonu, hidrojen peroksit ve glutamat 1 , 2 de dahil olmak üzere çeşitli nevrotoksinlere duyarlıdır. Bu nedenle, CGN kültürleri sinirbilimi alanında in vitro bir model olarak kullanılabilir. CGN kültürleri, CGN kültüründeki toplam hücrelerin yaklaşık% 1'ini oluşturabilen nöronlar ve glial hücreler de dahil olmak üzere çeşitli hücreler içerebilir. Bununla birlikte, glial hücreler, nöronlara kıyasla nörotoksinlere farklı şekilde tepki verirler, bu da kolorimetrik testler 3 ile ölçülen nöronal canlılığın önyargısına neden olurlar.
Canlı hücrelerde, floresein diasetat (FDA), esteraz ile floreseine dönüştürülebilir.Propidyum iyodür (PI) ölü hücrelere nüfuz ettikten sonra DNA ile etkileşime girebilir ve kültür içinde apoptozu göstermek için kullanılabilir. Bu nedenle, FDA-PI çift boyama, canlı hücre ve ölü hücreleri aynı anda değerlendirebilir, bu da, her iki kolorimetrik yöntemi birleştirerek hücrenin yaşayabilirliğinin daha doğru bir şekilde ölçülebileceğini düşündürür. Ayrıca, çekirdekler için mavi bir flüoresan lekesi olan Hoechst eklenerek hücre canlılığının doğruluğu daha da geliştirilebilir. Burada sunulan protokol, primer kültürlenmiş CGN'lerin nöronal canlılığını doğru bir şekilde analiz etmek için kullanılabilen FDA-PI çift boyama ve FDA-PI-Hoechst üçlü boyamayı anlatmaktadır.
Bu protokol CGN'leri ve glial hücreleri farklı boyut ve şekillerle görselleştirmek ve ayırt etmekten yararlanmaktadır. Boyama sonrasında, canlı nöronların ve ölü ölü hücrelerin sayıları, flüoresan mikroskobu ile alınan temsili görüntülerden sayılır. Büyük boyutlu glial hücreler, tipik CGN'lerin karşılaştırılmasıyla hariç tutulurFloresan modu altında afiş kontrast modunda alınan ile. Primer kortikal kültürler ve hipokampal kültürler gibi nöronlar ve glial hücreler içeren karışık hücre kültürlerinde nöronal canlılığı ölçmek için benzer bir strateji uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, daha önce 6 , 7'de açıklanan prosedürlerden değiştirildi. Araştırmacılar in vitro olarak birincil nöronlar kültür ederken koşulları iyileştirerek nöronal olmayan hücre büyümesini azaltmaya çalışmak için zaman harcadılar. Bununla birlikte, gelişmiş kültür koşullarıyla bile, bazı glial hücreler kalır. Ayrıca, nöronal büyüme ve olgunlaşma ile yardımcı oldukları için, primer nöronal kültürlerde n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Doğal Bilim Vakfı (LY15H310007), Zhejiang Eyaletinin Kar Amacı Gütmeyen Teknoloji (2016C37110) Uygulamalı Araştırma Projesi, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (U1503223, 81673407), Ningbo Uluslararası Bilim ve (2014D10019), Yaşam Bilim ve Sağlık Ningbo Belediye Yenilik Ekibi (2015C110026), Guangdong Eyalet Bilim ve Teknoloji Uluslararası İşbirliği Projesi (2013B051000038), Shenzhen Temel Araştırma Programı (JCYJ20160331141459373), Guangdong-Hong Kong Teknolojisi İşbirliği Fonlama Programı (GHP / 012 / 16GD), Hong Kong Araştırma Dekanlığı Konseyi (15101014), Hong Kong Politeknik Üniversitesi (G-YBGQ) ve Ningbo Üniversitesi'ndeki KC Wong Magna Fonu.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
References
- Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
- Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
- Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
- Labno, C. . Two way to count cells with ImageJ. , (2008).
- Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
- Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
- Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).
