Évaluation de la viabilité neuronale à l'aide de diacétate de fluorescéine-iodure de propidium Double coloration dans la culture du neurone de granulé céréalier
Summary
Ce protocole décrit comment mesurer avec précision la viabilité neuronale à l'aide de la diurétate de fluorescéine (FDA) et de la double coloration à l'iodure de propidium (PI) dans des neurones de granules cérébelleux cultivés, une culture neuronale primaire utilisée comme modèle in vitro dans les recherches en neuroscience et neuropharmacologie.
Abstract
Les neurones de granules céréaliers cultivés primaires (CGN) ont été largement utilisés comme modèle in vitro dans les recherches en neurosciences et neuropharmacologie. Cependant, la coexistence de cellules gliales et de neurones dans la culture CGN pourrait entraîner des biais dans l'évaluation précise de la viabilité neuronale. Le diacétate de fluorescéine (FDA) et la double coloration à l'iodure de propidium (PI) ont été utilisés pour mesurer la viabilité cellulaire en évaluant simultanément les cellules viables et mortes. Nous avons utilisé la double coloration FDA-PI pour améliorer les sensibilités des tests colorimétriques et pour évaluer la viabilité neuronale dans les CGN. En outre, nous avons ajouté des taches d'ADN fluorescentes bleues ( p. Ex. Hoechst) pour améliorer la précision. Ce protocole décrit comment améliorer la précision de l'évaluation de la viabilité neuronale en utilisant ces méthodes dans la culture CGN. En utilisant ce protocole, le nombre de cellules gliales peut être exclu en utilisant une microscopie à fluorescence. Une stratégie similaire peut être appliquée pour distinguer le gli indésirableAl-cellules de neurones dans diverses cultures de cellules mixtes, telles que la culture corticale primaire et la culture de l'hippocampe.
Introduction
Les tests de cytotoxicité colorimétrique, tels que le dosage du bromure de 3- (4, 5-diméthyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphényl-2-H-tétrazolium (MTT), sont couramment utilisés pour mesurer la viabilité cellulaire in vitro . Les neurones de granules céréaliers cultivés primaires (CGN) provenant de rats sont sensibles à diverses neurotoxines, y compris l'ion 1-méthyl-4-phénylpyridinium, le peroxyde d'hydrogène et le glutamate 1 , 2 . Par conséquent, les cultures CGN peuvent être utilisées comme un modèle in vitro dans le domaine des neurosciences. Les cultures de CGN peuvent contenir une variété de cellules, y compris les neurones et les cellules gliales, qui peuvent représenter environ 1% des cellules totales dans la culture CGN. Cependant, les cellules gliales répondent différemment aux neurotoxines par rapport aux neurones, conduisant à un biais dans la viabilité neuronale mesurée par des analyses colorimétriques 3 .
Dans les cellules viables, le diacétate de fluorescéine (FDA) peut être converti en fluorescéine par l'esterase.L'iodure de propidium (PI) peut interagir avec l'ADN après avoir pénétré des cellules mortes et peut être utilisé pour indiquer l'apoptose dans la culture. Par conséquent, la double coloration FDA-PI peut évaluer simultanément des cellules viables et des cellules mortes, ce qui suggère que la viabilité cellulaire peut être mesurée plus précisément en combinant les deux méthodes colorimétriques. De plus, en ajoutant Hoechst, une coloration fluorescente bleue pour les noyaux, la précision de la viabilité cellulaire pourrait encore être améliorée. Le protocole présenté ici décrit la coloration double FDA-PI et la coloration triple FDA-PI-Hoechst, qui peut être utilisée pour analyser avec précision la viabilité neuronale dans les CGN cultivés primaires.
Ce protocole profite de la visualisation et de la distinction des CGN et des cellules gliales par leurs différentes tailles et formes. Après la coloration, le nombre de neurones viables et de neurones morts est compté à partir d'images représentatives prises par microscopie fluorescente. Les cellules gliales de grande taille sont exclues par la comparaison des CGN typiques tAken sous le mode fluorescent avec ceux pris sous le mode de contraste de phase. Une stratégie similaire peut être réalisée pour mesurer la viabilité neuronale dans des cultures cellulaires mixtes contenant des neurones et des cellules gliales, telles que des cultures corticales primaires et des cultures d'hippocampes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole a été modifié à partir de procédures décrites précédemment 6 , 7 . Les chercheurs ont passé du temps à essayer de réduire la croissance des cellules non neuronales en améliorant les conditions lors de la culture des neurones primaires in vitro 8 . Cependant, même avec des conditions de culture améliorées, certaines cellules gliales restent. De plus, des cellules non neuronales sont nécessaires dans le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (LY15H310007), le Projet de recherche appliquée sur la technologie à but non lucratif de la province de Zhejiang (2016C37110), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (U1503223, 81673407), la science et la science internationales de Ningbo Projet de coopération technologique (2014D10019), l'équipe d'innovation municipale de Ningbo sur les sciences de la vie et la santé (2015C110026), le Projet de recherche internationale provincial de la science et de la technologie de Guangdong (n ° 2013B051000038), le programme de recherche de base de Shenzhen (JCYJ20160331141459373), Guangdong-Hong Le programme de financement de la coopération technologique de Kong (GHP / 012 / 16GD), le Conseil des subventions de recherche de Hong Kong (15101014), l'Université polytechnique de Hong Kong (G-YBGQ) et le Fonds KC Wong Magna à l'Université de Ningbo.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
References
- Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
- Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
- Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
- Labno, C. . Two way to count cells with ImageJ. , (2008).
- Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
- Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
- Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).
