Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma
Summary
Kalp biowire platformu elektrik stimülasyonu ile üç boyutlu hücre ekimi birleştirerek, insan embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde (hPSC-CM) olgun için kullanılan bir in vitro yöntem olup. Bu el yazması kardiyak biowire platformunun ayrıntılı kurulum sunar.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücre kökenli kardiyomyositler (hPSC-CM'ler) gelecek vaat eden hücre kaynağı olmuş ve böylece ilaç keşfi, hastalık modelleme, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp dahil kardiyak araştırmalarındaki potansiyel uygulamaların soruşturma teşvik ettik. Ancak, mevcut protokoller tarafından üretilen hücrelerin, doğal yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde kıyasla olgunlaşmamış bir dizi gösterir. Birçok çabaları şimdiye dek elde sadece ılımlı olgunlaşma, hPSC-CMS olgun yapılmıştır. Bu nedenle, biowire adı verilen bir mühendislik sistemi, in vitro olarak daha olgun bir duruma hPSC CMS kurşun fiziksel ve elektriksel iki ipuçları temin ederek oluşturulmuştur. Sistem bir giderek artan bir sıklık ile elektriksel alanla uyarıma tabi hizalanmış kardiyak doku (biowire) içine monte etmek için bir bükülmez şablon dikiş boyunca jel kolajen türü hPSC CMS tohum bir mikro-platformu kullanır. stimüle kontroller ile karşılaştırıldığında,biowired kardiyomiyositlerde yapısal ve elektrofizyolojik olgunlaşma geliştirilmiş bir derecede sergileyebilir uyarmıştır. Bu tür değişiklikler stimülasyon hızına bağlıdır. Bu yazının ayrıntılı olarak biowires tasarım ve oluşturulması açıklanmıştır.
Introduction
Hücresel tedavi kardiyak onarım / yenilenme ulaşmak için en umut verici ve incelenen stratejilerden biridir. Bu kalp doku mühendisliği ve biyomalzeme 1, 2 eş zamanlı verilmesi ile yardımcı olmuştur. En uygun hücre kaynakları hasarlı, hastalıklı veya yaşlı kalpleri 3 üzerindeki potansiyel yararlı etkileri için hayvan modellerinde incelenmiştir. Özellikle, önemli çabalar insan pluripotent kök hücresinin kullanmak için yapılmıştır (hPSC) kardiyomiyositlerde (hPSC-CM), kardiyak doku mühendisliği için potansiyel olarak sınırsız otolog hücre kaynağı -türetilmiş. hPSC-CM'ler çeşitli yerleşik protokoller 4, 5, 6 kullanılarak üretilebilir. Bununla birlikte, elde edilen hücreler yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde 7'ye göre olgunlaşmamış özelliklerinin bir dizi fetal benzeri fenotipler sergiler, </sup> 8. Bu ilaç keşif araştırma ve yetişkin kardiyak hastalık modellerinin 9 gelişiminde erişkin kalp dokusunun modelleri olarak hPSC-CM'ler uygulanmasına engel teşkil edebilir.
fenotipik olgunlaşmamışlığın bu sınırlamanın üstesinden gelmek için yeni yaklaşımlar aktif kardiyomiyosit olgunlaşmasını teşvik etmek için araştırılmaktadır. İlk çalışmalar, siklik mekanik 10 veya elektriksel uyarım 11 aracılığıyla yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde etkili ön-olgunlaşma özellikleri açığa çıkmıştır. Jel sıkıştırma ve siklik mekanik uyarma da elektrofizyolojik ve kalsiyum kullanım özelliklerinin en az donanımıyla hPSC-CM olgunlaşması 12, 13, bazı yönlerini geliştirdiği gösterildi. Bu nedenle, "biyolojik tel" (biowire) olarak adlandırılan bir platform sistemi yapısal işaretler ve elektrik alanı stimülasyon sağlamak suretiyle geliştirildiN hPSC-cm 14 olgunlaşmasını artırmak için. Bu sistem, elektriksel alanla uyarıma müsait hizalanmış kardiyak doku oluşturmak için bir mikro-platformu kullanır. Bu hPSC-cm yapısal ve elektrofizyolojik olgunluk geliştirmek için kullanılabilir. Burada, böyle biowires yapma ayrıntılarını açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazının hPSC-CM'ler olgunlaşmasını geliştirmek için, mühendislik platformu, biowire kurulumunu ve uygulanmasını açıklar. Cihaz, standart mikroimalat tesislerinde yapılabilir ve biowires ortak hücre kültürü teknikleri ve bir elektrik uyarıcı ile üretilebilir.
Bildiğimiz kadarıyla, biowires benzer hiçbir rapor yöntem yoktur. Bu strateji, yüksek uyarım oranı rampa rejimi (3 Hz karşı 6Hz) tabi biowires elde edilen daha büyük bir olgunlaşma düzeyi ile kanı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kanada Kalp ve İnme Kuruluşundan (G-14-0006265) hibe yardımı, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitülerinden işletme hibeleri (137352 ve 143066) ve bir JP Bickell vakfı hibesi (1013821 ) SSN'ye gönderir.
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
References
- Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005 (2015).
- Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and their application in cardiac regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 96, 183-194 (2016).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453 (7194), 524-528 (2008).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2355-H2363 (2003).
- Dolnikov, K., et al. Functional properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: intracellular Ca2+ handling and the role of sarcoplasmic reticulum in the contraction. Stem Cells. 24 (2), 236-245 (2006).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circ Res. 90 (2), 223-230 (2002).
- Radisic, M., et al. Functional assembly of engineered myocardium by electrical stimulation of cardiac myocytes cultured on scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (52), 18129-18134 (2004).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Lake, M., et al. Microfluidic device design, fabrication, and testing protocols. Protocol Exchange. , (2015).
- Shiba, Y., Hauch, K. D., Laflamme, M. A. Cardiac applications for human pluripotent stem cells. Curr Pharm Des. 15 (24), 2791-2806 (2009).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34 (23), 5813-5820 (2013).
- Radisic, M., et al. Oxygen gradients correlate with cell density and cell viability in engineered cardiac tissue. Biotechnol Bioeng. 93 (2), 332-343 (2006).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
