Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Bu protokol, tüm hasta verilerinin uygun de-kimlik ile kurumsal inceleme kurulu ve insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslar arası kurallara uygun olarak onayı ile yapılmıştır. önce bu protokol ile çalışmak için hastanın ailesinden tüm uygun kurumsal inceleme kurulu onayı ve bilgilendirilmiş onam edinin. 1. Doku Örnekleri elde edilmesi NOT: Bu protokolün önemli bir bileşeni otopsi sırasında hemen başlayan doku bağışı uygun kullanımını gerektirir. Genel örnek canlılığı, hemen antibiyotikler / antimikotik ile desteklenmiş uygun soğuk ortama doku transferi, Post-Mortem Aralığı (PMI) minimize ulaşım boyunca ıslak buz üzerinde örnek tutarak, ve protokol boyunca steril tekniği sürdürülmesine önemli ölçüde bağlıdır. bildirilmesi üzerineyakın bir bağış, bir örnek toplama kiti hazırlamak. aşağıda belirtilen maddeleri, doğrudan doku numunesinin geri taşınması için kullanılan bir yalıtılmış kap ile bir kargo kutusu içeren nin kullanımı: steril eldiven, örtüler ve neşter içeren steril hazırlanması için malzemeler arasında. buz veya soğuk paketleri ile yalıtılmış bir kapta 30 ml nakliye ortamı içeren 10 steril 50 ml konik tüpler – 8 arasındadır. Not: herhangi bir standart hücre kültür ortamı mümkündür, ama en iyi Örnek canlılığı antibiyotik / antimikotik ile takviye hazırda-A elde edilir. Diğer analizler (örneğin, fiksatif) için başka örnek tüplerini ekleyin. Otopsi araştırmacının sitesinde gerçekleştirilmez ise, açıkça tümör örnek toplamak için nasıl bildiren bir belge yer alıyor. Bu, tu olarak orta beyin ve medulla örnekler, sterilite korumak ıslak buz üzerinde örnek tüplerini tutarak ve dahil olarak ayrıntıları içerirmor hücreleri genellikle bu bölgeleri işgal. otopsi sırasında sterilite korumak. kafatası içinde steril beyin düşünün, bu yüzden kafatası açıldığında (değişen eldivenler dahil) steril tekniği gözlemleyin. cilt ve saç ile kirlenmesini önlemek önemlidir. Ventral yüzü tümörü teşrih (pons "göbek", Ek Şekil 1). steril bir bisturi ile tümörün küçük 1 cm parçaları kesilmiş ve hemen soğuk nakliye medya (adım 1.1.2 NOT bakınız) içine aktarmak ve ıslak buz koymak. 40 mL her bir tüp içinde doku ve ortamın bir son hacim elde her tüp içine doku 10 mL yerleştirin. NOT: DIPG durumunda, tümör diffüz sık pons ve beyin geri kalanı infiltratlar. pons dan – (40 mL doku 30) ve 1-4 tüpler – orta beyin ve medulla – (20 mL doku 10) her 2 tüpler gibi, tipik olarak 3 de dahil olmak üzere, mümkün olduğunca örnek kadar toplamak. Sam toplayınorta beyin ve medulla gelen ples genellikle birçok tümör hücreleri içeren pons, bitişik. Numune toplama sonra, yalıtılmış bir kapta ıslak buz üzerinde örnekleri O / N gemi. donma hücreleri öldürür gibi, kuru buz üzerinde örnek gemi yok. Örnek İşleme 2. Hazırlık Önceki numune hazırlama başlamadan 1 saat UV ışığı altında Jilet, kavisli hemostatlarla ve diğer steril olmayan araçlarla birlikte doku kültürü davlumbaz sterilize edin. kültürlerin kirlenmesini önlemek üzere steril koşullar altında, aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirir. Hazırlayın ve steril filtre çözümleri. 1.8 M sukroz çözeltisi hazırlamak için, distile su, 300 mL 308,07 g sakroz çözülür. Ekle 50 ml 10x kalsiyum ve magnezyum içermeyen saline solüsyonu (HBSS) Hank's tamponlu ve damıtılmış su ile 500 mL toplam hacim getirmek. 4 ° C'de saklayın. enzimatik sindirim solüsyonu hazırlamak için, 5 almak0 ml kıyılmış doku, her 10 mL kalsiyum ve magnezyum ile HBSS, 500 uL 5 mg / ml deoksiribonükleaz I (nihai konsantrasyon 50 ug / ml), 500 uL 2.5 mg / mL kolajenaz I / II ve dispaz çözeltisi (nihai konsantrasyon 25 ekleme ug / mL) ve 500 uL 1 M HEPES tamponu. 37 ° C su banyosu içinde ön ısıtılması sindirim çözeltisi. tümör kök ortamı (TSM) taban hazırlamak için, 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı karışımı: Besin Karışımı F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x antibiyotik antimikotik, 5 ml 200 mM L-alanil-L- glutamin dipeptit (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES tamponu, 5 ml 100 mM sodyum piruvat, ve 5 mL 100X MEM esansiyel olmayan amino asitler yer alır. TSM tabanına aşağıdaki ek ekleme, büyüme faktörleri ile birlikte TSM hazırlamak için: 50x B27 eki eksi Vitamini (1:50), insan epidermal büyüme faktörü (lH-EGF, 20 ng / ml), insan fibroblast büyüme faktörü (H- FGF, 20 ng / ml), insan trombosit türevli büyüme faktörü AA (lH-PDGF-AA, 10 ng / ml),insan platelet türevli büyüme faktörü BB (lH-PDGF-BB, 10 ng / ml) ve heparin çözeltisi (2 ug / ml). 4 ° C'ye kadar bir sallanma-kepçeli rotor ile donatılmış bir laboratuar tipi santrifüj ön soğutma. 3. Mekanik Ayrılma yüksek duvarlı 100 mm x 20 mm hücre kültür çanağı içine doku aktarın. nakliye gelen medya leftover çıkarın ve 10 ile değiştirin – 15 ml soğuk kültür ortamı. Kavisli hemostat kullanarak, bir tıraş bıçağı kavramak bariz kan damarları veya meninksler çıkarırken ince doku kıyma için. NOT: Son doku parçaları, 1 mm'den daha küçük olmalıdır (Şekil 1B'ye bakınız). temiz bir 50 ml konik tüp içine doku aktarın. ilave bir 5 mL soğuk kültür ortamı ile hücre kültürü bulaşık yıkama ve konik tüp aktarın. kalan doku aktarımı için gerekli bu yıkama işlemi tekrarlayın. (- 5 defa 4), 10 ml serolojik pipeti kullanarak, yavaşça Karışım. Büyük Tiss izinue fragmanları tüpün dibine yerleşmek için. Gerekirse, kısa bir süre 1 dakika boyunca (350 xg, 4 ° C) örnek santrifüj. Mekanik ayrışmış fraksiyonu toplayın. Süpernatantı ve etiketli yeni bir 50 ml konik tüp içine 100 mikron filtre aracılığıyla filtre "Mekanik Ayrılma." Orijinal konik tüp üzerinde filtre ters çevirin ve doku parçaları kurtarmak için kültür ortamı ile yıkayın. 5 dakika (350 xg, 4 ° C) "Mekanik Ayrılma" fraksiyonu santrifüj. peletlenmiş "Mekanik Ayrılma" kısmından Süpernatantı ve soğuk kültür ortamı içinde doku tekrar süspansiyon. "Mekanik Ayrılma" konik tüp doku fazla 5 ml ise, herhangi bir tüp en fazla 5 ml doku sahip olduğu şekilde, diğer 50 ml konik tüp içine doku ayrıldı. (Sukroz gradient santrifüj adım kadar Ste buz üzerinde mekanik ayrışmış kısmını Mağazap 5). Alternatif olarak, mekanik olarak ayrışmış kesir enzimatik ayrılma inkübasyon süresi (Adım 4.4) sırasında Adım 5'e devam edebilirsiniz. 4. Enzimatik Ayrılma Geri kalan daha büyük bir doku parçaları ihtiva eden bir tüp içinde doku fazla 5 mL varsa, herhangi bir tüp en fazla 5 ml doku sahip olduğu şekilde diğer yeni 50 ml konik tüp içine doku ayrıldı. 5 dakika (350 xg, 4 ° C) kalan doku parçalarını içeren konik boru (lar) santrifüjleyin. Önceden ısıtılmış enzimatik sindirim çözeltisi Süpernatantı ve ekleme, her 1 ml doku 5 ml Sindirim solüsyonu olduğu şekilde (örneğin, 5 ml doku için 25 ml sindirim çözeltisi). laboratuar film ile konik tüp kapaklar kapatılır ve 30 dakika boyunca 37 ° C 'de, bir döndürücü üzerinde reaksiyon inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, (Şekil 1C bakınız) yavaşça örnekleri Karışım. 10 ml serolojik pipet kullanılarak,pipet örnek yukarı ve 6 aşağı – 8 kez. Aşırı hava kabarcıkları oluşturarak kaçının. pipetlemeyin sonuna kadar 1000 uL pipet ucu ekleme ve ek 6 çiğnemek – 8 defa. kalan parçaları tüpün dibine yerleşmek için izin verin. Çıkarın ve hala "Enzimatik Ayrılma" etiketli yeni bir 50 ml konik tüp içine 100 mikron filtre ile askıya hücreleri ile süpernatant filtre ve buz üzerinde saklayın. önemli doku parçaları kalırsa, fragmanlara kalsiyum ve magnezyum ile ek 10 ml HBSS ekleyin ve tekrar 3.5.1 ve 3.5.2 adımları. "Enzimatik Ayrılma" tüp içine 100 mikron filtre ile bu nihai çözüm Filtre. 5 dakika (350 xg, 4 ° C) "enzimatik ayrılma" tüp santrifüj ve sukroz gradyanlı santrifüjleme devam etmektedir. 5. Sükroz Gradyan Santrifüjü Geri Numuneler de Çözelti Santrifüj içerisinde süspanse halinde5 dakika (350 xg, 4 ° C) ge. Kalsiyum ve magnezyum olmadan 20 ml soğuk HBSS supernatant ve tekrar süspansiyon doku çıkarın. Soğuk HBSS ile 25 ml toplam hacim kadar getirin. Yavaş yavaş 25 ml 1.8 M sükroz çözeltisi ekleyip karıştırın tüp ters. Bu 0.9 M sukroz gradyanı ile sonuçlanır. 10 dakika (800 xg, 4 ° C) için bir fren santrifüjleyin. Degrade bozabilir ve verimi azaltır (öncesi ve santrifüj sonrası numunenin bir örnek için Şekil 1D bakınız) bir santrifüj fren kullanma. Dikkatle miyelin enkaz ve mümkün olduğunca sakaroz çözeltisini aspire. kalsiyum ve magnezyum olmadan 30 ml soğuk HBSS ekleme ve hafifçe karıştırılarak numune yıkanır. 5 dakika (350 xg, 4 ° C) santrifüj. 6. ACK Kırmızı Kan Hücresi Lizis yıkama süpernatantı. 5 ml ACK lisiz tamponu ekleyin ve yavaşça oda sıcaklığında 1 dakika boyunca tüp dönen, hücre pelletini. l Söndürmekalsiyum ve magnezyum olmadan 30 ml soğuk HBSS ekleyerek Salman kararı. 5 dakika (350 xg, 4 ° C) santrifüj. 7. İlk Kültür Bakım büyüme faktörleri sıcak komple TSM 15 mL ve tripan mavi eksklüzyonu kullanılarak hemasitometre viyabl hücre yoğunluğu ölçmek – 10 son hücre pelletleri yeniden süspanse edin. NOT: canlı hücre aralığı yaygın doku bağışı koşullara bağlı olarak değişir, ve miktar nedeniyle artık hücresel enkaz, bu erken aşamada zor olabilir. İdeal bir durumda, örnek başına bir milyon canlı hücreleri olması amaçlanmıştır. Aşırı artık bir T175 şişesi içinde daha düşük bir yoğunlukta, kalan plaka durumlarda. Yeni T75 kültür şişesine son hücre süspansiyonları aktarın. Ek büyüme faktörlerini de başak toplam büyüme faktörü seviyeleri korumak ve tümör hücre neurospheres gelişimi izlemek için her gün (Şekil 1E ve Şekil 2). Seçenek olarak ise, akış sitometrisi ve floresans ile aktive edilmiş hücre sıralama içeren, daha fazla analiz için proses enzimatik ayrışan hücreler. (Ortalama 3 alır – 4 hafta, ama sürece 2 ay gibi bir kaç gün arasında değişir) neurospheres geliştikten sonra, enkaz miktarını azaltmak için 100 mikron naylon örgü filtre kullanarak örnek filtresi ters. NOT: Süzülen madde olarak tek hücre ya da küçük küreler olması durumunda, kültür içinde muhafaza edilmelidir. İlk hasta örneği karşılaştırarak, Pasajlanması sırasında DNA parmak izi yaparak kültür bütünlüğünü ve saflığını sağlamak.