I neuroni di imaging all'interno di sezioni di cervello spesse Uso del metodo di Golgi-Cox

La visualizzazione dei singoli neuroni all'interno di campioni di tessuto consente l'analisi in situ di Neuron caratteristiche morfologiche, che ha notevolmente avanzato la nostra comprensione del cervello e come può essere influenzata dalla malattia endogena o fattori ambientali esogeni. Il metodo di colorazione Golgi-Cox è una soluzione economica, mezzi relativamente semplici di colorando un campione casuale di neuroni nel cervello. Primo sviluppato da Golgi ¹ e modificato da Cox ² nel 1800, i ricercatori hanno ulteriormente perfezionato questa tecnica nel corso degli anni per produrre chiare neuroni, ben colorate, che possono essere utilizzati per visualizzare e quantificare sia albero dendritico morfologia e densità delle spine ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

Una considerazione importante tecnica per la visualizzazione dei neuroni colorati all'interno delle sezioni cerebrali è lo spessore massimo fetta, che è limitata dalla distanza di lavoro di alto ingrandimento / obiettivi del microscopio ad alta risoluzione disponibili. Obiettivi ad immersione in olio comuni nel 60 – 100X raggio forniscono un'eccellente risoluzione, ma sono limitati dalla loro distanze di lavoro che sono in genere non superiore a 200 micron. Sezioni di cervello tagliato al micron tra 200 possono essere sufficienti per visualizzare alcuni tipi di neuroni che possono essere contenuti all'interno di questo spessore di strato, ad esempio neuroni piramidali negli strati superficiali della corteccia cerebrale ^{10, 11, 12,} neuroni piramidali della regione CA1 della ippocampo ^{13, 14,} e cellule granulari del giro dentato dell'ippocampo ^15. I neuroni con relativamente più lungoalberi dendritiche, come i neuroni piramidali raggio strati profondi della corteccia cerebrale che per il mouse può estendersi oltre 800 um dal corpo cellulare ^16, forniscono una sfida maggiore perché dovrebbero essere sezionati a un angolo perfetto cervello per contenere l'intero albero dendrite entro 200 micron fette. Questo può anche non essere fattibile se un dendrite o uno dei suoi rami si estendono in direzione rostrale o caudale. Mentre è possibile affrontare questa limitazione tracciando un neurone in più sezioni di cervello adiacenti, questo approccio introduce una sfida tecnica significativa allineamento delle sezioni accuratamente per tracciare ^17. Un approccio più pratico sarebbe visualizzare intere neuroni contenuti in sezioni di cervello che vengono tagliati a spessore maggiore.

Riportiamo qui una tecnica per colorare i neuroni all'interno di 400-500 micron di spessore sezioni del cervello di topi con il metodo di Golgi-Cox, e visualizzare il loro morphology utilizzando un obiettivo ad immersione in olio di silicone ad alta risoluzione che ha una distanza di lavoro di 800 um. L'impregnazione e l'elaborazione del protocollo Golgi-Cox che descriviamo viene modificato da uno dei protocolli moderni più citati nella letteratura ^6. Il nostro approccio con sezioni di cervello spesse offre il vantaggio di aumentare la probabilità di identificare neuroni di qualsiasi tipo che sono completamente contenuto all'interno della sezione. Oltre al protocollo principale, abbiamo anche presentare due varianti che forniscono vantaggi unici: (1) colorazione Golgi-Cox con la controcolorante violetto cresolo sulla superficie delle sezioni montate, al fine di definire i confini di regioni cerebrali e identificare strati della corteccia cerebrale, e (2) Golgi-Cox colorazione con una fase di congelamento intermedio per la conservazione a lungo termine di cervelli interi impregnate prima del sezionamento e lavorazione finale.