मोटी मस्तिष्क धारा गोल्जी-कॉक्स विधि का प्रयोग भीतर इमेजिंग न्यूरॉन्स
Summary
हम मोटी मस्तिष्क वर्गों में गोल्जी-कॉक्स धुंधला विधि का उपयोग कर, क्रम में लंबे वृक्ष के समान एक ऊतक के नमूने के भीतर निहित के पेड़ के साथ न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल के दो वेरिएंट भी प्रस्तुत कर रहे हैं कि शामिल cresyl बैंगनी counterstaining, और लंबी अवधि के भंडारण के लिए असंसाधित दिमाग की ठंड।
Abstract
न्यूरॉन धुंधला की गोल्जी-कॉक्स विधि ऊतकीय मस्तिष्क के नमूने के भीतर न्यूरॉन आकृति विज्ञान की हमारी समझ अग्रिम करने के लिए और अधिक से अधिक दो सौ साल के लिए नियोजित किया गया है। हालांकि यह, सबसे बड़ी मोटाई संभव पर मस्तिष्क वर्गों को तैयार करने के क्रम में रंगीन न्यूरॉन्स कि पूरी तरह से एकल वर्गों में शामिल हैं की पहचान करने की संभावना में वृद्धि करने के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण से बेहतर है, इस दृष्टिकोण उच्च के काम दूरी के अनुसार एक तकनीकी नजरिए से सीमित है -magnification माइक्रोस्कोप उद्देश्यों। हम यहाँ माउस मस्तिष्क वर्गों में गोल्जी-कॉक्स विधि है कि 500 सुक्ष्ममापी मोटाई में कटौती कर रहे हैं का उपयोग कर न्यूरॉन्स दाग के लिए, और एक ईमानदार खुर्दबीन एक उच्च संकल्प 30X 1.05 एनए सिलिकॉन के साथ लगे का उपयोग कर इन वर्गों की गहराई भर न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट तेल विसर्जन उद्देश्य एक 800 सुक्ष्ममापी काम कर दूरी है। हम भी इस प्रोटोकॉल कि की सतह counterstain के लिए नियोजित किया जा सकता की दो उपयोगी वेरिएंट रिपोर्टcresyl वायोलेट निससल दाग के साथ मस्तिष्क वर्गों घुड़सवार, या सेक्शनिंग और अंतिम संसाधन से पहले लंबी अवधि के भंडारण के लिए पूरे दिमाग को फ्रीज करने। मुख्य प्रोटोकॉल और उसके दो वेरिएंट रंगीन मोटी मस्तिष्क वर्गों, जो भर में पूर्ण न्यूरॉन वृक्ष के समान पेड़ों और डेन्ड्राइट कांटा मज़बूती से देखे जा सकते हैं और मात्रा निर्धारित उत्पादन।
Introduction
ऊतक के नमूने के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के दृश्य न्यूरॉन आकारिकी लक्षणों की सीटू विश्लेषण है, जो मस्तिष्क की हमारी समझ उन्नत काफी है और यह कैसे अंतर्जात रोग या एक्सोजेनस पर्यावरणीय कारकों से प्रभावित हो सकता है के लिए अनुमति देता है। गोल्जी-कॉक्स धुंधला विधि एक लागत प्रभावी, मस्तिष्क के भीतर न्यूरॉन्स के नमूने के तौर पर धुंधला की अपेक्षाकृत सरल साधन है। सबसे पहले 1800 में गोल्जी 1 द्वारा विकसित और कॉक्स 2 द्वारा संशोधित, शोधकर्ताओं ने आगे पिछले कुछ वर्षों में इस तकनीक को परिष्कृत किया है स्पष्ट, अच्छी तरह से दाग न्यूरॉन्स कि कल्पना और दोनों वृक्ष के समान पेड़ आकृति विज्ञान और रीढ़ की हड्डी घनत्व 3, 4 यों किया जा सकता है निर्माण करने के लिए, 5, 6, 7, 8, 9।
मस्तिष्क वर्गों के भीतर दाग न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए एक प्रमुख तकनीकी विचार अधिकतम टुकड़ा मोटाई है, जो उपलब्ध उच्च आवर्धन / उच्च संकल्प माइक्रोस्कोप उद्देश्यों के काम दूरी के अनुसार सीमित है। 60 में आम तेल विसर्जन उद्देश्यों – 100X उत्कृष्ट समाधान प्रदान सीमा है, लेकिन उनके काम दूरी है कि आम तौर पर कोई 200 सुक्ष्ममापी से अधिक हैं द्वारा सीमित हैं। मस्तिष्क वर्गों 200 सुक्ष्ममापी रेंज में कटौती कुछ न्यूरॉन प्रकार है कि इस टुकड़ा मोटाई के भीतर समाहित किया जा सकता है, सेरेब्रल कॉर्टेक्स 10, 11, 12, के सीए 1 क्षेत्र में पिरामिड न्यूरॉन्स के उथले परतों में उदाहरण के पिरामिड न्यूरॉन्स के लिए कल्पना करने के लिए पर्याप्त हो सकता है हिप्पोकैम्पस 13, 14, और ग्रेन्युल हिप्पोकैम्पस 15 के देंताते जाइरस में कोशिकाओं। अपेक्षाकृत लंबे समय तक साथ न्यूरॉन्सइस तरह के सेरेब्रल कॉर्टेक्स की गहरी परतों के भीतर पिरामिड न्यूरॉन्स कि माउस सेल शरीर 16 से 800 से अधिक सुक्ष्ममापी विस्तार कर सकते हैं के लिए, एक अधिक से अधिक चुनौती प्रदान करते हैं क्योंकि दिमाग पूरे डेन्ड्राइट पेड़ को रोकने के लिए एक आदर्श कोण पर sectioned किया जा करने की आवश्यकता होगी के रूप में वृक्ष के समान पेड़, 200 सुक्ष्ममापी स्लाइस के भीतर। यह भी संभव नहीं हो सकता है अगर एक डेन्ड्राइट या उसकी शाखाओं में से किसी व्याख्यान चबूतरे वाला या दुम दिशा में विस्तार। हालांकि यह कई आसन्न मस्तिष्क वर्गों में एक न्यूरॉन अनुरेखण द्वारा इस सीमा को संबोधित करने के लिए संभव है, इस दृष्टिकोण 17 अनुरेखण के लिए सही ढंग से वर्गों संरेखित में एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करता है। एक और अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण मस्तिष्क वर्गों है कि अधिक से अधिक मोटाई में कटौती कर रहे हैं के भीतर निहित पूरे न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए किया जाएगा।
गोल्जी-कॉक्स पद्धति का उपयोग करके चूहों के 500 सुक्ष्ममापी मोटी मस्तिष्क वर्गों, और उनके मो कल्पना करने के लिए – हम यहाँ 400 के भीतर न्यूरॉन्स दाग के लिए एक तकनीक की रिपोर्टrphology एक उच्च संकल्प सिलिकॉन तेल विसर्जन उद्देश्य एक 800 सुक्ष्ममापी काम कर दूरी है कि का उपयोग कर। गोल्जी-कॉक्स संसेचन और प्रसंस्करण प्रोटोकॉल है कि हम का वर्णन साहित्य 6 में सबसे उद्धृत आधुनिक या प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है। मोटी मस्तिष्क वर्गों के साथ हमारा दृष्टिकोण किसी भी प्रकार कि पूरी तरह से अनुभाग के भीतर समाहित कर रहे हैं के न्यूरॉन्स की पहचान करने की संभावना को बढा का लाभ प्रदान करता है। मुख्य प्रोटोकॉल के अलावा, हम भी उपस्थित दो वेरिएशन कि अद्वितीय फायदे प्रदान करते हैं: (1) घुड़सवार वर्गों की सतह पर cresyl बैंगनी counterstain साथ गोल्जी-कॉक्स धुंधला क्रम में मस्तिष्क क्षेत्रों की सीमाओं को परिभाषित करने के लिए और की परतों की पहचान के लिए सेरेब्रल कॉर्टेक्स, और सेक्शनिंग और अंतिम संसाधन से पहले गर्भवती पूरे दिमाग की लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक मध्यवर्ती ठंड कदम के साथ (2) गोल्जी-कॉक्स धुंधला।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ दो उपयोगी वेरिएंट के साथ एक गोल्जी-कॉक्स धुंधला प्रोटोकॉल मोटी मस्तिष्क वर्गों के भीतर न्यूरॉन्स दृश्यमान करने के लिए का वर्णन। के रूप में प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया गया है, एक लंबे 800 सुक्ष्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद, अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI परियोजना संख्या 30,381) से CDCB करने के लिए एक जॉन आर इवांस नेताओं फंड अनुसंधान बुनियादी ढांचे अनुदान, और द्वारा से CDCB करने के लिए एक डिस्कवरी अनुदान द्वारा समर्थित किया गया NSERC से NJM करने के लिए एक डिस्कवरी अनुदान। ELL एक ओंटारियो ग्रेजुएट छात्रवृत्ति द्वारा और Guelph विश्वविद्यालय में ओंटारियो पशु चिकित्सा कॉलेज से OVC छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया। सीडीएस NSERC से एक स्नातक छात्र अनुसंधान assistantship द्वारा समर्थित किया गया। एएलएम NSERC से एक एलेक्जेंडर ग्राहम बेल छात्रवृत्ति द्वारा और Guelph विश्वविद्यालय में ओंटारियो पशु चिकित्सा कॉलेज से OVC छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
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