Método agitador magnético para Detecção de<em> Trichinella</em> As larvas em amostras de músculo

1. Preparações coleta de amostras Nota: O método de agitador magnético pode ser utilizado para as amostras musculares individuais ou agrupados. Recolher amostras dos locais de predilecção apropriados e em uma quantidade adequada 9. Refira-se às exigências do país ou para as recomendações de TIC, OIE ou ISO. Para a União Europeia, por exemplo, tirar uma amostra de 1 g de um dos pilares do diafragma na zona de transição para a parte tendinosa de suínos domésticos. Certifique-se de que todas as amostras musculares estão livres de toda a gordura e fáscia. Se a língua é testado, remover a camada superficial antes do teste. Tome cuidado se as amostras são congeladas, como a maioria das larvas Trichinella não são congelar resistente e desenrole após a morte, são menos resistentes à digestão e tendem a aderir às paredes do recipiente, resultando em diminuição da sensibilidade do ensaio. Nota: Se congelado, o dobro do tamanho da amostra em lleste e aumentar o tempo de sedimentação (ver abaixo). Preparação do líquido de digestão Adicionar HCl a 25% (16 ± 0,5 mL) para 2 L de água da torneira pré-aquecida a 46-48 ° C em um copo de vidro de 3 litros. Muito baixo de uma temperatura resulta na digestão incompleta; muito alto de uma temperatura desactiva as propriedades enzimáticas da pepsina. Colocar uma barra de agitação no recipiente, e agita-se a solução sobre uma placa pré-aquecida (46-48 ° C). Adicionar 10 ± 0,2 g de pepsina (1: 10000 NF, 1: 12500 BP, 2000 FIP) para a solução ácida. Nota: A qualidade da pepsina é de extrema importância e atividade da enzima deve ser certificado pelo produtor. Por razões de segurança laboratoriais e manter a actividade da pepsina, a sequência da adição de componentes de fluidos de digestão devem ser respeitados. Preparação de amostras do músculo Pique até 100 g de amostras de músculo em um liquidificador ou moedor. Para facilitar blending, adicione 2 mL pré-aquecido água para as amostras e misture em velocidade máxima para 2 – 3 s. Antes da segunda mistura, abrir o misturador e transferir qualquer amostra de músculo no topo da margem da borda tigela de mistura para a parte inferior e a mistura de repetição. Continue misturando com rajadas de 2 – 3 s até que não haja pedaços visíveis de carne permanecem. Nota: Muito pouco de mistura pode resultar na digestão incompleta, enquanto muito mistura pode danificar o Trichinella larvas presentes nas amostras 6. 2. Procedimento Digestão de amostras do músculo Transferir 1 L de fluido de digestão em forma de cilindro. Transfira a carne moída no copo e difundir no fluido de digestão com uma colher ou garfo. Enxaguar a taça tampa do copo misturador, lâmina e liquidificador com 500 ml do líquido de digestão pré-aquecido para a 3 L proveta. Nota: lavagem incompleta pode resultar na perda de Sensitivity. Cobrir a proveta com folha de alumínio e manter uma temperatura constante de 44-46 ° C e monitor com um termómetro. Agita-se a digestão de fluido durante 30 min para criar um vórtice sem salpicos de profundidade até que as partículas de carne desapareçam. Dependendo do tipo de carne testada (por exemplo, carne de animais selvagens), aumentar o tempo de digestão, até um máximo de 60 minutos. A filtração e sedimentação do líquido de digestão Para determinar a quantidade de tecido não digerido, ajustar a escala a zero, pese a peneira antes de usar, e anote o seu peso. A peneira deve estar limpa e desprovida de quaisquer partículas de tecido, o que poderia dificultar as larvas Trichinella atingir o funil de sedimentação. Verifique se o funil de separação é nivelado verticalmente. Após a digestão, enchimento com o líquido de digestão através de um crivo de 180 um para uma ampola de separação de vidro. A largura do funil de separação de vidro não deve be maior do que 55% do comprimento para permitir uma boa sedimentação larva. Tome cuidado para evitar qualquer excesso. Para evitar a perda de sensibilidade, lavar bem o copo de vidro e a peneira com cerca de 200 ml de água da torneira de um frasco de lavagem e transferir a água da lavagem para o funil de sedimentação de vidro. Ter o cuidado de lavar cuidadosamente as bordas do recipiente de 3 L. Levantar o crivo e lavar a área sob a peneira completamente. Determinação da quantidade de tecido não digerido Nota: devido a erros na execução do método, o tecido muscular pode permanecer no peneiro, como bem fáscia e do tecido conjuntivo, que não são digeríveis. A quantidade de tecido não digerido é determinada durante o primeiro passo de sedimentação de 10 minutos (ver 2.5). Isto permite cerca de 30 min para a peneira para secar, tal como água residual pode influenciar o peso determinado do tecido não digerido. Coloque uma toalha de papel em uma escala, e pesar o crivo que tem os undigestecidos ted. Subtrair o peso peneira antes da filtração do peso peneiro com tecidos não digeridos. O processo de digestão é considerada satisfatória se não mais do que 5% do peso inicial da amostra permanece no peneiro (isto é, 5 g / 100 g de material de partida). Se a quantidade de tecido não digerido é superior a 5%, repetir o teste usando amostras de músculo fresco. Se o tecido restante é predominantemente composta de tecido muscular não digerido e amostras frescas não estão disponíveis, digerir os restos não digeridos novamente e analisar, em adição às amostras originais. A sedimentação do líquido de digestão Manter o líquido de digestão filtrada no funil de separação durante 30 min. Se deixado em repouso, as larvas Trichinella vai assentar no fundo do funil. Se forem utilizadas amostras congeladas, aumentar o tempo de sedimentação para um máximo de 60 minutos. Uma vez que a sedimentação é completa, abra totalmente a torneirado funil de separação para permitir que, pelo menos, 40 ml do fluido de digestão rápida fugir em um cilindro de medição (80 mL se amostras do músculo tinha sido previamente congelado). Em primeiro lugar, vamos metade do fluido para dentro do cilindro e, em seguida, abrir completamente a válvula na direcção oposta para permitir que 10 mL de fluido de digestão para passar. Finalmente, abrir a torneira de passagem no sentido oposto por mais 10 ml. Este procedimento garante que Trichinella larvas não são presos na torneira. Nota: velocidade suficiente é necessária para evitar larvas restante no funil de separação, diminuindo a sensibilidade. A sedimentação do líquido de digestão no cilindro Deixar o sedimento no cilindro, durante 10 min para permitir que as larvas se sedimentar. Retirar 30 ml de sobrenadante por aspiração com uma pipeta, sem perturbar o sedimento de 10 mL. Para reduzir a quantidade de fibras de tecido na amostra, adicionar 30 mL de água da torneira para o sedimento e sair para o outro a 10 m. Repita até que o líquido é clara. Remover o sobrenadante e transferir os 10 ml lavado sedimentos para uma placa de Petri em grade ou bacia para a contagem das larvas. Lavar o cilindro com 10 mL de água da torneira e, em seguida, adicionar a água à amostra. Observação: Como grandes quantidades de detritos no interior da amostra pode impedir a identificação das larvas Trichinella (Figura 1), mais passos de lavagem deve ser realizada, se necessário. Exame microscópico Use um triquinoscópio ou um estereomicroscópio com uma fonte de luz sub-estágio transmitida de intensidade ajustável em um 15 a ampliação de 20x para examinar as amostras imediatamente após as etapas de lavagem. Após o vazamento da amostra na placa de Petri em grade, examine o prato / bacia sistematicamente rede pela grade. Se não houver estruturas suspeitos são encontrados, mova suavemente o líquido na placa de Petri em grade ou bacia para a contagem das larvas em uma forma circular para permitir que qualquer la Trichinellarvae, que foram potencialmente negligenciado, a acumular-se no centro da placa de Petri. Repetir o exame. Se uma estrutura suspeito é encontrado, aumentar a ampliação de 40 – 100X. Remover Trichinella larvae do prato / bacia com uma pipeta e recolher num tubo com 90% de etanol. Após o prato completo foi examinado, repetir o procedimento, a partir da agitação suave do prato / bacia. Repita o procedimento pelo menos três vezes ou até não mais larvas são encontradas. Contar o número de larvas. Correlacionam-se com a quantidade de tecido muscular testado e presente como larvas por grama (GLP). Se muitas larvas estão presentes no fluido de digestão para determinar o número de larvas de forma confiável, o retorno do fluido contendo as larvas para o cilindro de medição, enxaguar com água da torneira de um frasco de lavagem, e deixar que as larvas se depositam no fundo. Depois de um tempo de sedimentação de 10 minutos, reduz-se o sobrenadante a um volume definido (por exemplo,10 mL). Para determinar o volume exacto, transferir o sobrenadante para um novo cilindro com uma pipeta. Suspender larvas homogeneamente no fluido, por agitação vigorosa. Durante o movimento de agitação, adicionar 12 gotas de 20 ul de suspensão de larvas para uma placa de Petri. Examine cada gota por microscópio. Determinar o número de larvas em 240 mL e apagar a contagem mais alta e mais baixa. Extrapolar o número de larvas para o volume total (por exemplo 10 ml) de sobrenadante. Nota: A qualidade do microscópio estéreo é de suma importância para a identificação de larvas de Trichinella. Quando as larvas são coletadas em um tubo por uma pipeta, verifique cuidadosamente que as larvas não ficar na parede da pipeta, mas transferidos para o tubo. Nota: achados triquinas positiva a partir de amostras colectivas deve ser rastreada a partir da piscina para a carcaça de origem. Aqui, o tamanho da piscina deve ser progressivamente reduzido até que a carcaça positiva é idencado. O tamanho da amostra também pode ser aumentada durante este processo para aumentar a sensibilidade. Sempre que o exame de uma amostra colectiva produz um resultado positivo ou duvidoso, uma amostra de 20 g é retirada de cada porco. As amostras de 20 gramas provenientes de cinco suínos devem ser reunidas e examinadas usando o método descrito. Desta forma, serão examinadas amostras de 20 grupos de cinco suínos. Se forem detectadas triquinas numa amostra combinada de cinco suínos, amostras de 20 gramas são recolhidos a partir dos porcos individuais no grupo e cada um é examinado separadamente até que seja detectada a carcaça positiva de origem.