Kinetiek van Achterblijvende-streng DNA-synthese<em> In Vitro</em> Door de bacteriofaag T7 Replication Eiwitten
Summary
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
De replicatie van DNA is geconserveerd kenmerk van alle cellulaire leven. Hoewel de identiteit en het aantal replicatie componenten sterk variëren, zijn de algemene mechanismen gedeeld over de evolutie 1. We beschrijven gel gebaseerde discontinue kinetische experimenten, met behulp van radioactieve substraten, gericht op het begrijpen van de kinetiek van achterblijvende streng DNA synthese in vitro door componenten van de T7 replisome. De replicatiemachinerie van bacteriofaag T7 is zeer eenvoudig, bestaande uit slechts vier eiwitten (DNA polymerase, GP5 en de processivity factor, E. coli thioredoxine, de bifunctionele primase-helicase GP4, en de enkelstrengs DNA-bindend eiwit, GP2. 5) 2. Deze functie maakt het een aantrekkelijke modelsysteem om de geconserveerde biochemische mechanismen van DNA-replicatie bestuderen.
Speciale nadruk wordt gelegd op de vorming van ribonucleotide primers door T7 DNA primase, een criticaIk stap in de initiatie van DNA-synthese. Bovendien kan men ook het gebruik van deze primers door T7 DNA- polymerase replicatie of andere eiwitten onderzocht door ze in het reactiemengsel. De T7 primase-helicase, GP4, katalyseert de vorming van primers voor DNA-synthese op specifieke DNA-sequenties genoemd primase herkenningsplaatsen of PRS, (5'-GTC-3 '). De cytosine in het PRS cryptisch, is het essentieel voor herkenning van de website, maar het is niet gekopieerd naar het product 3. De eerste stap in de synthese primer door GP4 omvat de vorming van het dinucleotide pppAC, die vervolgens wordt uitgebreid tot een trimeer en uiteindelijk functionele tetranucleotide primers pppACCC, pppACCA of pppACAC afhankelijk van de sequentie in de mal 4. Deze primers kunnen vervolgens worden gebruikt door T7 DNA polymerase om DNA-synthese, die ook een gp4 werkwijze met 5, 6 initiëren. In dit opzicht is de primasedomein stabiliseert de extreem korte tetraribonucleotides de sjabloon, voorkomen van dissociatie grijpt DNA polymerase zodanig bevorderlijk is voor een primer / matrijs in de polymerase actieve plaats 7. Deze stappen (RNA primer synthese primer handoff te polymerase en extensie) worden herhaald in meerdere cycli op de bekledings bundel repliceren en worden gecoördineerd met de replicatie van de belangrijke bundel.
De hier beschreven assays zijn zeer gevoelig en kan worden uitgevoerd in een gematigd tijdsbestek. Ze zijn echter relatief lage-throughput en goede zorg moet worden betracht bij het gebruik en de verwijdering van radioactieve stoffen. Afhankelijk van de snelheid waarmee de reactie verloopt, kan men een snelle quench-instrument te gebruiken om monsters opbrengen op tijdschalen vatbaar voor zinvolle analyse reactietijd gangen in zowel de constante of de pre-steady state. Onlangs hebben we gebruikten assays hier beschreven evidenc biedene van het belang van primer vrijlating uit de primase domein van GP4 in de inleiding van Okazaki fragmenten. Bovendien toonden we aan een regulerende rol voor het T7 enkelstrengs DNA-bindend eiwit, gp2.5, voor de efficiëntie van vorming en gebruik 8 primer.
Protocol
Representative Results
Discussion
De belangrijkste factor bij het uitvoeren van deze experimenten is de beschikbaarheid van zeer actieve gezuiverd enzym. Tijdens ons werk met GP4, bijvoorbeeld, vonden wij dat de opslag van het gezuiverde enzym in buffer (20 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) bevattende 50% glycerol bij -20 ° C leidt tot een vermindering de specifieke activiteit van het preparaat over een paar maanden. Daarom hebben we nu flash-freeze kleine fracties gezuiverd gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA replication. , (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
