Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak
Summary
Bu makalede, tanımlamak ve hücre içi boyama ile fare böbrek, aort ve lenf düğümleri içinde mevcut fonksiyonel T lenfosit alt grupları ölçmek ve akım sitometri ayrıntılı bir metodoloji sağlar. anjiotensin II hipertansiyon modeli açıklamak adım-adım, usul ve flow sitometri temel ilkelerine ve hücre içi boyama seçildi.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
Son kanıtlar, adaptif bağışıklık sisteminin, özellikle de T lenfositler, çok sayıda kalp-damar hastalıkları 1,2,3,4,5 gelişiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Örneğin, anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonu modelinde, gemiler ve farelerin böbreklerinde T hücrelerinin birikimi 6 tarif edilmiştir. damar birikim adventisya ve perivasküler yağ ağırlıklı olarak. Böbrekte, T hücreleri, medulla ve renal korteksten hem de birikir. Dahil olduğu alt kümesi bağlı olarak, bu T hücreleri vasküler ve böbrek fonksiyonlarını etkileyebilir ve patolojinin gelişmesine yol açabilir farklı sitokinler doğuran (McMaster ve ark., 6 tarafından gözden).
CD4 + T yardımcı lenfositler çok alt-grup halinde ayrılabilir: fonksiyonları ve imza sito göre T yardımcı 1 (Th1), Th2 Th9, Th17, Th22, regülatör T (regülatör) hücreleri ve T yardımcı foliküler (TFH) hücrelerkines 7. Benzer şekilde, CD8 + sitotoksik T hücreleri Tc1, TC2, Tc17 ya TC9 8 olarak sınıflandırılabilir. (CD4 veya CD8 T hücresi işaretlerini ifade yoktur, yani hücreleri) çift negatif T hücreleri bulunmaktadır. Bu hücrelerin bir alt alternatif bir gama delta T hücre reseptörü (yerine klasik alfa ve beta reseptörleri) sahiptirler ve bu nedenle, gama, delta T hücreleri olarak ifade edilir. yüzey işaretleyici, sitokin ve transkripsiyon faktörü flow sitometri çok parametre analizi bu hücreleri tanımlamak için en iyi yaklaşım oluşturmaktadır. Bu yöntem geniş bir immünoloji alanında kullanılmasına rağmen, bu daha az katı organlar ve kalp-damar hastalıklarının bir ortamda tarif edilmektedir.
Tarihsel olarak, dokularda lenfosit tanımlama immünohistokimya ya da RT-PCR yaklaşımlar ile sınırlı kalmıştır. immünohistokimyasal ve immünofloresan int bir antijenin doku dağılımını belirlemek için güçlü yöntemler olmasına rağmenerest, onlar fenotipik ilgili alt grupları tanımlamak için yetersiz kalmaktadır. RT-PCR analizi antijenleri, sitokinler ya da transkripsiyon faktörleri mRNA ekspresyonunu tespit etmek için yararlıdır Buna ek olarak, bu aynı zamanda tek tek hücreler seviyesinde çok proteinlerin tespiti izin vermez.
sitokinler ve transkripsiyon faktörleri tespit etmek için hücre içi boyama ile birlikte, özellikle flow sitometri gelişi, katı organlarda immün hücre alt tek hücre düzeyinde belirlenmesi ve niceliksel olanak sağlayan güçlü bir teknikle araştırmacılar sağlar. Bu, anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonu modelinde kemirgen böbrek, aort ve aort lenf düğümleri içinde bulunan ana T hücre alt akış sitometrisi ile tespit etmek, bir hücre içi boyama tahlili optimize ettik. Çok yeniden bir doku sindirim, ex vivo aktivasyonu, permeabilization ve yüzey ve hücre içi boyama sonuçları: her adımın optimizasyonuDiğer kardiyovasküler ve böbrek hastalığı modellerinde uygulanabilir üretilebilir deneyi.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma FL bir Amerikan Kalp Derneği Bursu Ödülü (16POST29950007), Sağlık (NIH T32 HL069765) BLD, MA Salih bir Amerikan Kalp Derneği Bursu Ödülü (14POST20420025) için National Institutes of bir eğitim hibe ve bir NIH tarafından desteklenen K08 ödülü MSM (HL121671). MSM de Gilead Sciences, Inc. bir araştırma bursu ile desteklenmektedir
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -. W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O’Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
