Summary

Hedeflenen<em> In situ</emBudding Maya> Mutajenezis Histon ve Genler

Published: January 26, 2017
doi:

Summary

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Abstract

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Introduction

Dört çekirdekli histon proteinleri H2A, H2B, H3, H4 ve ökaryotik kromozomların sıkıştırma, organizasyon ve fonksiyonunda önemli rol oynarlar. Bu histonlar her iki set sonuçta nükleozom 1 oluşumu ile sonuçlanır, histon oktameri, kendi etrafında DNA ~ 147 baz çifti sarma yönlendiren bir molekül makara oluşturur. Nükleozomlar bu tür kromozom üzerinde gen transkripsiyonu düzenlenmesi ve ökromatin oluşumu ve heterokromatin olarak kromozom tabanlı süreçleri, çeşitli aktif katılımcılar vardır ve gibi, son birkaç on yıl boyunca yoğun bir araştırmanın odak noktası olmuştur. Bu mekanizmalar histon kalıntılarının sonrası modifikasyon, ATP-bağımlı nükleozom remodeling ve ATP-bağımsız nükleozom yeniden düzenlenmesi dahil – bir takım mekanizmalar hangi nükleozom belirli işlemlerin uygulanmasını kolaylaştırabilir yollarla manipüle edilebilir tarif edilmiştirve montaj / demontaj 2, 3.

Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae ökaryotlarda histon işlevinin anlaşılması için özellikle güçlü bir model organizmadır. Bu büyük ölçüde etki ökaryotlarının boyunca histon proteinlerinin evrimsel korunması yüksek derecede ve genetik ve biyokimyasal deneysel çeşitli maya amenability isnat edilebilir 4 yaklaşır. maya Ters genetik yaklaşımlar yaygın kromatin biyolojinin çeşitli yönlerine ilişkin belirli histon mutasyonların etkilerini incelemek için kullanılır olmuştur. deneyler bu tür için anormal hücre içi (nedeniyle hücrelerde plazmidlerin sayıları değişen) histon proteinleri seviyeleri ve yol açabilir bağımsız plazmidlerden ifade mutant histonlar kendi ana genomik lokusları eksprese edildiği hücrelerin kullanımı genellikle tercih edilir kromatin tr eş zamanlı değişikliksonuçta sonuçların yorumunu karıştırabilir vironments.

Burada, genomu içinde kalan eksojen DNA sekansları olmadan arzu edilen mutasyon (lar) ın üretiminde bir klonlama aşaması ve sonuç gerektirmez kendi ana genomik konumlarda histon genlerinin hedeflenen mutagenezi için izin veren bir PCR bazlı teknik açıklar. Bu teknik, maya etkili homolog rekombinasyon sistemi yararlanır ve diğer gruplar tarafından geliştirilen diğer benzer teknikler ile ortak birçok özelliğe sahiptir – özellikle Delitto Perfetto, alana özgü genomik (SSG) mutajenez ve klonlama içermeyen PCR bazlı alel yedek yöntemleri 5, 6, 7. Bununla birlikte, tarif tekniği özellikle histon gen mutagenezi için çok uygundur hale getiren bir yönü vardır. haploid maya hücreleri, dört çekirdek histon her iki olmayan a göre kodlanmıştırllelic ve yüksek ölçüde homolog genlerin: Örneğin, histon H3 HHT1 ve HHT2 genleri tarafından kodlanan ve iki genin açık okuma çerçeveleri (ORF'ler), sırayla% 90 üzerinde özdeştir. homoloji Bu yüksek derecede spesifik mutagenez için iki histon-kodlayan genlerin biri hedef için tasarlanmış deneyler karmaşık hale getirebilir. Yukarıda bahsedilen yöntemler genellikle homolog rekombinasyon sürücü hedef genin ORF içinde en azından bazı dizilerin kullanılmasını gerektirir ise, burada tarif tekniği için (daha az sekans benzerliği paylaşan) histon gen ORF eteklenen dizileri kullanır rekombinasyon adımı ve böylece arzu edilen mahaline mutagenez başarılı hedefleme olasılığını arttırır. Ayrıca, rekombinasyonu sürücü homolog bölgeleri daha verimli hedeflenen homolog rekombinasyon katkıda çok geniş olabilir.

Protocol

Not: in situ histon geni mutagenez hedef için deneysel strateji (Şekil 1 'de özetlenmektedir) çeşitli adımlar içerir. Bu adımlar şunlardır: URA3 geni hedef histon geninin (1) değiştirilmesi, (2) üretimi ve arzu edilen mutasyon (lar) yataklık primerler kullanılarak, hedef histon geninin iki kısmen üst üste parçalarının karşılık gelen PCR ürünlerinin saflaştırılması (3 ) kısmen örtüşen parçalarının PCR erimesi işaretleyici ile plazmit ü…

Representative Results

In situ mutagenez stratejisi hedef arasında temsili bir örnek olarak, bir glutamik asit (mutan H3-R53E) bir arjininden pozisyonda 53 bir ikame barındıran bir histon H3 mutan proteini ifade eden bir hht2 alel üretilmesini tarif eder. Biz HHT2 bütün ORF URA3 geni (protokol aşamasını 1 e bakınız) ile ikame edildiği bir soy elde. Bu soy, yAAD156 da hücrelerin histidin içi…

Discussion

Haploid S. cerevisiae hücreleri dört temel histon proteinlerinin her biri için kod özel mutagenez için iki genin biri hedeflemek isteyen araştırmacılar için bir meydan okuma temsil edebilir olmayan iki alel genler arasındaki dizi homoloji yüksek düzeyde. Daha önce sık kullanan, Delitto Perfetto, alana özgü genomik (SSG) mutajenez ve klonlama içermeyen PCR bazlı alel değiştirme yöntemleri 5, 6, 7…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.

Materials

1 kb DNA Ladder (DNA standards) New England BioLabs N3232L
Agarose  Sigma A5093-100G
Boric Acid Sigma B0394-500G
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific R0192
EDTA solution (0.5M, pH 8.0) AmericanBio AB00502-01000
Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific 16-100-824
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma E4884-500G
Lithium acetate dihydrate Sigma L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler BioRad 170-9703
Poly(ethylene glycol) (PEG) Sigma P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  and 5X buffer Fisher Scientific 50-443-960
Salmon sperm DNA solution ThermoFisher Scientific 15632-011
Sigma 7-9 (Tris base, powder form) Sigma T1378-1KG
Sodium acetate trihydrate Sigma 236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) AmericanBio AB00985-00100
Taq Polymerase and 10X Buffer New England BioLabs M0273X
Toothpicks Fisher Scientific S67859
Tris-HCl (1M, pH 8.0) AmericanBio AB14043-01000
a-D(+)-Glucose Fisher Scientific AC170080025 for yeast media
Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 for yeast media
Peptone Fisher Scientific DF0118-07-2 for YPD medium
Yeast Extract Fisher Scientific DF0127-17-9 for YPD medium
4-aminobenzoic acid Sigma A9878-100G for complete minimal dropout medium 
Adenine Sigma A8626-100G for complete minimal dropout medium 
Glycine hydrochloride Sigma G2879-100G for complete minimal dropout medium 
L-Alanine Sigma A7627-100G for complete minimal dropout medium 
L-Arginine monohydrochloride Sigma A5131-100G for complete minimal dropout medium 
L-Asparagine monohydrate Sigma A8381-100G for complete minimal dropout medium 
L-Aspartic acid sodium salt monohydrate Sigma A6683-100G for complete minimal dropout medium 
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamic acid hydrochloride Sigma G2128-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamine Sigma G3126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma H8125-100G for complete minimal dropout medium 
L-Isoleucine Sigma I2752-100G for complete minimal dropout medium 
L-Leucine Sigma L8000-100G for complete minimal dropout medium 
L-Lysine monohydrochloride Sigma L5626-100G for complete minimal dropout medium 
L-Methionine Sigma M9625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Phenylalanine Sigma P2126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Proline Sigma P0380-100G for complete minimal dropout medium 
L-Serine Sigma S4500-100G for complete minimal dropout medium 
L-Threonine Sigma T8625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tryptophan Sigma T0254-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tyrosine Sigma T3754-100G for complete minimal dropout medium 
L-Valine Sigma V0500-100G for complete minimal dropout medium 
myo-Inositol Sigma I5125-100G for complete minimal dropout medium 
Uracil Sigma U0750-100G for complete minimal dropout medium 
Ammonium Sulfate Fisher Scientific A702-500 for complete minimal dropout medium 
Yeast Nitrogen Base Fisher Scientific DF0919-07-3 for complete minimal dropout medium 
5-Fluoroorotic acid (5-FOA) AmericanBio AB04067-00005 for  5-FOA medium

References

  1. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  2. Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
  3. Rando, O. J., Winston, F. Chromatin and transcription in yeast. 유전학. 190 (2), 351-387 (2012).
  4. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. 유전학. 197 (1), 33-48 (2014).
  5. Storici, F., Resnick, M. A. Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides. Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).
  6. Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast. BMC Biotechnol. 4, 7 (2004).
  7. Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).
  8. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
  9. Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. Manipulation of cloned yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  10. Hoffman, C. S. Preparation of yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  11. Treco, D. A., Lundblad, V. Preparation of yeast media. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  12. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).
  13. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 122 (1), 19-27 (1989).
  14. Johnson, P., et al. A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics. G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).
  15. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  16. Cross, S. L., Smith, M. M. Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).
  17. Libuda, D. E., Winston, F. Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).

Play Video

Cite This Article
Duina, A. A., Turkal, C. E. Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (119), e55263, doi:10.3791/55263 (2017).

View Video