Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Ibrahim B. Durowoju; Kamaljit S. Bhandal; Jian Hu; Bruce Carpick; Marina Kirkitadze

doi:10.3791/55262

JoVE Journal > Biochemistry

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생화학

Calorimetría diferencial de barrido - un método para evaluar la estabilidad térmica y la conformación del antígeno proteico

Published: March 04, 2017

doi:

10.3791/55262

Ibrahim B. Durowoju¹, Kamaljit S. Bhandal¹, Jian Hu¹, Bruce Carpick¹, Marina Kirkitadze¹

¹Analytical Research & Development,Sanofi Pasteur Limited

Summary

Calorimetría diferencial de barrido mide la temperatura de transición térmica (s) y la energía total de calor requerida para desnaturalizar una proteína. Los resultados obtenidos se utilizan para evaluar la estabilidad térmica de los antígenos de proteínas en formulaciones de vacunas.

Abstract

calorimetría diferencial de barrido (DSC) es una técnica analítica que mide la capacidad de calor molar de muestras como una función de la temperatura. En el caso de muestras de proteínas, los perfiles de DSC proporcionan información acerca de la estabilidad térmica, y en cierta medida sirve como una "huella dactilar" estructural que se puede utilizar para evaluar la conformación estructural. Se lleva a cabo usando un calorímetro de barrido diferencial que mide la temperatura de transición térmica (temperatura de fusión; T _m) y la energía requerida para romper las interacciones que estabilizan la estructura terciaria (entalpía; H) de las proteínas. Se hacen comparaciones entre las formulaciones, así como los lotes de producción, y las diferencias en valores derivados indican diferencias en la estabilidad térmica y la conformación estructural. Los datos que ilustran el uso de los CAD en un entorno industrial para estudios de estabilidad, así como el seguimiento de los pasos clave de fabricación se proporcionan como prueba de la efectividad de este proProtocolo. En comparación con otros métodos de evaluación de la estabilidad térmica de conformaciones de las proteínas, DSC es rentable, requiere unos pasos de preparación de muestras, y también proporciona un perfil termodinámico completo del proceso de despliegue de la proteína.

Introduction

La calorimetría diferencial de barrido (DSC) es un método experimental que mide directamente la diferencia en la absorción de la energía de calor que tiene lugar en una muestra respecto a una referencia durante un cambio regulado temperatura ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ^{^8,} ⁹ ^, ^{^10,} ^{^11,} ^12. Llevado a cabo en un calorímetro diferencial de barrido, el método implica introducir energía térmica en una celda de muestra y una celda de referencia simultáneamente mientras idénticamente el aumento de la temperatura tanto de las células con el tiempo ^{^2,} ^{^13,}14. Debido a la diferencia en la composición de la muestra y la referencia, se requerirá diferente cantidad de energía para elevar la temperatura de las células ^{^2,} ^{^12,} ^13. Por lo tanto, la cantidad en exceso de energía requerida para compensar la diferencia de temperatura entre las células y se mide directamente correlacionada con las propiedades termodinámicas específicas de la muestra ^{^1,} ^3.

En la década de 1960, MJ O'Neil y E. Watson de Perkin Elmer desarrollaron la primera calorímetro diferencial de barrido para medir el flujo de calor de los materiales sólidos ^{^2,} ^{^3,} ^4. En paralelo, PL Privalov y DR Monaseldze EL del Instituto de Física de la República de Georgia (antigua URSS) crearon un calorímetro adiabático diferencial único que puede utilizarse for investigación bioquímica ^{^5,} ^6. Posteriormente, el equipo de Andronikashvili en el Instituto de Física de la República de Georgia, informó la capacidad calorífica de biomoléculas tales como proteínas fibrosas y globulares, ADN y ARN utilizando DSC ^{^7,} ^{^8,} ^9. Varios equipos dirigidos por Sturtevant ^{^10,} ^{^11,} ^12, ¹³ Brandts, y Privalov ^{^14,} ^{^15,} ¹⁶ se centraron en el desarrollo de la teoría y las aplicaciones prácticas de DSC para investigar los detalles termodinámicas de despliegue de proteínas. El valor de DSC en el estudio de grandes estructuras supramoleculares tales como fagos, cloroplasto, cristales líquidos, de fosfolípidos y proteínas de la carne también se han notificado ¹⁷ </ ^sup>, ^{^18,} ^{^19,} ^20.

DSC ahora se ha convertido en un lugar común en la investigación farmacéutica y el desarrollo para la evaluación de la estabilidad térmica de las biomoléculas, especialmente proteínas ^{^1,} ^{^21,} ^22. Esto se debe principalmente a los avances en términos de sensibilidad y la automatización de la instrumentación utilizada para llevar a cabo el experimento ^{^23,} ^24. Aquí, el resultado final del experimento DSC, a saber, la capacidad de calor molar como una función de la temperatura, se utiliza para estimar los siguientes parámetros termodinámicos (cambio en la capacidad calorífica (ΔCp), la entalpía (H), la entropía (? S) y energía libre de Gibbs (? G)) mediante la siguiente ecuación:

eq1.jpg "/> (1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Donde Cp se mide la capacidad de calor; q es el flujo de calor en el material de prueba; T ₀ y T son las temperaturas inicial y final de la transición, respectivamente, ^{^22,} ^25. También vale la pena señalar que las ecuaciones anteriores se aplican a las proteínas de un solo dominio que puede experimentar una transición de dos estados y reversible desplegamiento térmico ^22. El análisis de las proteínas más complejas (por ejemplo, proteínas, no de dos estados, y oligómeros) have sido reportado por Freire et al. ^26; Johnson et al. ^27; y Kasimova et al. ^28.

Para determinar si una proteína se somete a la transición de los dos estados o forma intermedios durante la desnaturalización térmica, la entalpía obtenido experimentalmente (? H; también se hace referencia como entalpía calorimétrica? H _Cal) se compara con la entalpía derivada usando la ecuación de van't Hoff se indica a continuación (también referido como entalpía de van't Hoff;? H _VH):

(6)

Donde T _es la temperatura del punto medio de la transición, R es la constante de gas ideal (1,987 cal mol ^-1 K ^-1) e Y es la fracción de la población de proteínas en el estado desplegado ^{^16,} ^29. Si? H _VH es igual a? H _Cal; ? H o _VH /? H _Cal es igual a 1, entonces la proteína se somete a un "todo o nada" de transición (es decir, la transición de dos estados) ^{^16,} ^{^25,} ^29. Sin embargo, si? H _VH es inferior a _Cal? H; ? H o _VH /? H _Cal es menor que 1, la proteína sufre una transición que no es de dos estados ^{^16,} ^{^25,} ^29. La relación de? H _VH /? H _Cal también corresponde a la proporción de la estructura de la proteína que se funde como una unidad cooperativa termodinámico o dominio ^26.

Los parámetros termodinámicos mencionados anteriormente, tales como? G? H y proporcionan información útil sobre la estabilidad térmica de proteínas, incluyendo los biológicos ^30. Sin embargo, se hará hincapié en la T _m? H y en esta publicación, ya que son los valores reportados para este protocolo. _Tm es la temperatura de punto medio de la transición, en el que el doblado y los estados no plegadas de la proteína están en equilibrio (es decir,? G = 0) ^{^25,} ^31. Cuanto mayor es la T _m de una proteína, mayor es su estabilidad térmica ^31. ? H corresponde al área bajo el pico (s) de la capacidad calorífica frente a Gráfico de temperatura (también conocido como termograma) generado al final del experimento DSC ^{^16,} ^25. Es la energía requerida para desnaturalizar las proteínas y se puede utilizar para estimar la fracción activa (F _a) en una formulación de proteína (es decir, la proporción de proteínas con conformación activa en una muestra) usando la siguiente ecuación:

jove_content ">

(7)

Donde? H es la entalpía derivada experimentalmente de la muestra de proteína y Q es la entalpía determinada para una referencia bien caracterizado o proteína normalizado ^22. La estimación de F _a es importante para el control de la estabilidad en tiempo real de los productos, así como la realización de estudios de estabilidad bajo condiciones de estrés como es requerido por las directrices ICH ^32. Comparación de? H también proporciona información sobre la compacidad de la estructura terciaria de una proteína de conformación ^31.

Este protocolo detalla un procedimiento de evaluación de la estabilidad térmica de las proteínas en un entorno industrial y se ha utilizado ampliamente para la formulación de vacunas. Fue desarrollado utilizando un calorímetro diferencial de barrido automatizado que genera resultados reproducibles fo concentraciones de proteína tan bajas como 300 mg / ml.

Protocol

1. Instrumento de puesta en marcha Encender el calorímetro de barrido diferencial y aumentar la presión en las células para suprimir la ebullición de las muestras, así como a evitar la formación de burbujas a temperaturas elevadas. Esto se consigue normalmente mediante el suministro de nitrógeno en el sistema. Dependiendo del material constitutivo de dicha célula (por ejemplo, tantalio, oro, platino, etc.), ajustar la presión del suministro de gas de nitrógeno de acuerdo con la presión recomendada por el fabricante para evitar daños en la célula. Por ejemplo, establezca la presión del suministro de gas nitrógeno a 45 psi para el instrumento utilizado para desarrollar este procedimiento, y la presión por encima de 80 psi puede dañar la célula. Asegúrese de que todos los reservorios de agentes de limpieza se llenan en el volumen requerido. Los productos de limpieza requeridos incluyen agua y detergente para lavar y limpiar la celda, respectivamente, después de cada carrera de la muestra. Ajuste la temperatura del compartimiento de la muestra sosteniendoa un valor adecuado, preferiblemente 5 ° C, para mantener la integridad de la muestra antes del experimento. Preparación 2. Muestra Se dializa la muestra contra el tampón que se utiliza como la referencia para el experimento. Alternativamente, el tampón de elución recogida en el paso final de la purificación de proteínas (es decir, la elución de la columna) se puede utilizar. Determinar la concentración de la muestra de proteína usando el método de determinación de la concentración de proteínas más adecuado, tal como método Kjedahl 33 o el método de Lowry 34. Para la comparación objetiva de los resultados, utilice el mismo método consistente en el mismo estudio. El intervalo de concentración requerido puede variar según el modelo del instrumento. Para el instrumento utilizado en este protocolo, el rango de trabajo preferible es de 0,5 – 1 mg / ml. Desgasificar el tampón de muestra y de referencia en el vacío para deshacerse de microburbujas que pueden causar inaccur volumenACY. Este paso se puede omitir para los modelos más nuevos de calorímetro. Usando una micropipeta y puntas esterilizadas en una cámara de flujo laminar flujo laminar, cargar las muestras y su respectiva memoria intermedia de dos en dos placas de 96 pocillos compatibles con el instrumento. Llenar los dos primeros pares de pocillos con tampón y los dos últimos pares con agua para el buffer-tampón y la exploración de agua, respectivamente. Escaneos de amortiguamiento tampón verificar la idoneidad del instrumento antes de la medición de la muestra (es decir, determinación de errores de instrumentación), así como establecer una línea de base; mientras que las exploraciones de agua se ejecutan para limpiar las células. Cubrir la placa de 96 pocillos con una lámina de sellado, y asegurar que los pozos estén debidamente sellados antes de tomar la placa fuera de la cabina de bioseguridad para evitar la contaminación de la muestra. Colocar la placa en el compartimento de la muestra que sostiene en la orientación correcta. 3. Configuración experimental de parámetros Nota: Dependiendo de la instrumentation, las muestras se pueden cargar en la célula de forma manual con una jeringa, o automáticamente utilizando un muestreador automático. En este caso (es decir, un entorno industrial), un muestreador automático se utiliza para ahorrar tiempo. Usando el software de adquisición, introduzca la información de la muestra en el orden de la placa se carga indicada en la sección 2.4. Introduzca concentraciones si está disponible, de lo contrario, introduzca los valores de concentración en el software de análisis previo al análisis de datos (sección 4.2). Seleccione la opción que garantiza una limpieza de las células con detergente antes de cada exploración de la muestra, que debe ser seguido por varias etapas de aclarado de agua para asegurar que no los restos de detergente que queda en las células. Establecer la temperatura de inicio del experimento a 20 ° C, pero esto puede variar dependiendo de un conocimiento previo de la muestra. Para las proteínas conocidas, la temperatura de partida pre-determinado puede ser utilizado, mientras que una temperatura inicial más baja se puede aplicar para las muestras desconocidas. Ajuste la temperatura finaldel experimento, por ejemplo, 100 ° C. La temperatura final puede variar en función de un conocimiento previo de la muestra. Ajuste la velocidad de barrido del experimento, por ejemplo, 60 ° C / h, que es el factor de ciclo típico. Sin embargo, velocidad de barrido puede variar en función de un conocimiento previo de la muestra, por ejemplo, 90 ° C / h, o 120 ° C / h. Es aconsejable para escanear muestras desconocidas a diferentes velocidades de exploración para evaluar la cinética de despliegue. Volver a examinar muestras para investigar la reversibilidad del desplegamiento térmico. El despliegue de una proteína se considera reversible si la entalpía obtenido para la segunda exploración es de al menos 80% del valor de entalpía para la primera exploración. Ajuste el termostato post-experimento a 10 ° C para preservar la integridad de las células del calorímetro. Compruebe que los parámetros de configuración del experimento son correctos antes de ejecutar el experimento. Si todo está en su lugar, iniciar el experimento. 4. Un DataANÁLISIS Recuperar datos en bruto a partir del experimento y seleccione una muestra a la vez para su análisis. Reste la exploración de referencia, es decir, tampón, del análisis de la muestra. NOTA: la resta de referencia se lleva a cabo automáticamente por los nuevos modelos de aparatos DSC. Introducir el valor de concentración de la muestra si se omitió indicada en la sección 3.1. Montar y restar línea de base desde el termograma adquirida para dar cuenta de las diferencias en las capacidades caloríficas de los estados plegado y desplegado de la proteína que es causada por la exposición de los grupos hidrófobos de agua al despliegue. Linear o de ajuste de curva cúbica se pueden aplicar dependiendo de la forma del perfil de DSC para la muestra. Por coherencia, el mismo tipo de conexión tiene que ser utilizado durante un estudio, por ejemplo, estudio de estabilidad en tiempo real. Este paso es necesario para procesar la curva para la integración de picos para obtener entalpía de transición. Realizar la integración de picos mediante ajuste no lineal de mínimos cuadrados. Sobre la base de productoel conocimiento se aplica de dos estados o modelo no dos estados. modelo de dos estados puede ser utilizado para las transiciones térmicas de cooperación individuales, y de proteínas desconocidas, se aplica modelo de estado no-dos hasta nuevo conocimiento del producto está disponible. En su caso, ajuste el ajuste de curva utilizando la curva de función de ajuste iterativo de software del equipo hasta que el valor de Chi-cuadrado se mantiene constante. Los resultados obtenidos se muestran los valores para el punto medio de temperaturas de transición (Tm), entalpía calorimétrica (H), y la entalpía de van't Hoff (? H VH) de la muestra.

Representative Results

Los datos en bruto de la mayoría de los experimentos de DSC se presentan como un flujo de calor frente a gráfico de la temperatura, como el calorímetro mide realmente la diferencia en la tasa de flujo de calor en la solución de muestra y el tampón 35. Por lo tanto, si las dos células (es decir, células de la muestra y de referencia) contienen soluciones idénticas durante un experimento, los datos en bruto de la exploración debe ser una línea plana sin picos observables. Cualquier pico observado se puede atribuir a un error de instrumentación (por ejemplo, dañado o contaminado células), por lo que se realizan exploraciones de tampón antes de su análisis de la muestra es un ensayo de idoneidad adecuada. La Figura 1 ilustra el resultado de un análisis típico de amortiguación que indica que el calorímetro estaba en buenas condiciones de trabajo antes de su análisis de la muestra. La Figura 2 muestra los datos en bruto para un experimento de DSC llevado a cabo en diffErent lotes de dos muestras de proteínas. Como indica anteriormente, los picos observados son las diferencias en el flujo de calor de las muestras y sus respectivas memorias intermedias. Las diferencias en la concentración de la muestra pueden causar variaciones en la capacidad de calor registrada por el calorímetro; Sin embargo, estas variaciones se normalizan durante el análisis de la muestra según el punto 4.2 del procedimiento. Las concentraciones más altas también pueden revelar dominios termodinámicas adicionales no contribuir a la transición a concentraciones más bajas. Además, cada transición representa un dominio termodinámica que puede incluir uno o más dominios estructurales de la proteína 36. En este caso, la proteína 1 tiene tres dominios estructurales que se funden de manera cooperativa. La Figura 3 muestra los resultados generados a partir del análisis de los datos en bruto para la proteína 1 y 2 presentados en la Figura 2, es decir, después de la sustracción de línea de base e iterativo curva fitting. Los termogramas resultantes se han normalizado para la velocidad de barrido (llevado a cabo de forma automática mediante un algoritmo preestablecido en el software de análisis) y la concentración; Por lo tanto, la presentación de los resultados del experimento en la capacidad de calor comparable frente a gráficos de temperatura. El software de análisis utiliza los datos de la capacidad calorífica frente a los gráficos de temperatura, tales como Tm y ΔCp, para derivar otros parámetros termodinámicos utilizando variaciones de las ecuaciones dadas anteriormente, según la cooperatividad de desplegamiento de la proteína. Al probar las muestras desconocidas, estableciendo el rango de temperatura adecuado es esencial. De lo contrario, termogramas incompletas pueden dar como resultado, como se ilustra en la Figura 4. Aunque T m de tales perfiles se puede derivar,? H no se puede determinar con precisión. Por lo tanto, la muestra debe ser analizado de nuevo con un rango de temperatura más grande para capturar completamente la transición térmica. Algunas proteínas también reforma adily agregados después de la desnaturalización completa, lo que resulta en una capacidad de calor posterior a la transición creciente: esto a menudo aparece como un termograma incompleta como se ilustra en la Figura 2B. Sin embargo, volver a probar con una temperatura final superior puede ayudar a confirmar si hay una aparición de una transición conformacional en esa región del termograma o no es más que el efecto de absorción de calor de agregados de proteínas. La estabilidad térmica es una de las propiedades físicas más importantes de las proteínas y los productos a base de proteínas en la industria 37. En los productos farmacéuticos, se utiliza para determinar la estabilidad de los productos biológicos bajo diferentes condiciones, incluyendo tampones de formulación y los factores ambientales tales como la humedad y la temperatura. También se utiliza para controlar el paso de fabricación de tecla (por ejemplo, purificación y desintoxicación) para asegurar la consistencia entre lotes de producción conformacional. <strong > Figuras 5 y 6 ilustran el uso de DSC para examinar los efectos de las condiciones de desintoxicación y almacenamiento de productos químicos, respectivamente, sobre la estabilidad y la conformación estructural de dos proteínas diferentes. Las diferencias significativas en la TM y? H indican cambios conformacionales y la degradación de proteínas, respectivamente. Además, la pérdida de la tercera transición en la Figura 6 ilustra además la degradación de un dominio que fue confirmado por una disminución en el peso molecular cuando las muestras se analizaron mediante cromatografía de exclusión con multi-ángulo de dispersión de luz (SEC-MALS) ( datos no mostrados). Figura 1: Tampón de exploraciones. La similitud en el gradiente de cada exploración sin picos observables indica que el instrumento está en buenas condiciones de trabajo y genera resultados reproducibles.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Los datos brutos recogidos a partir de experimentos de DSC. Estos gráficos son buenas representaciones de los datos no analizados (crudos) adquiridos después de corridas experimentales (es decir, antes de la sustracción de la línea de base y el ajuste de la curva). Cada línea representa un lote de producción. Proteína 2 tiende a agregarse más fácilmente tras el calentamiento, lo que resulta en un aumento de la capacidad de calor por encima de 100 ° C en la región posterior a la transición de la termograma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <br/> Figura 3: Analizado DSC de datos. Estos gráficos son buenas representaciones de datos de DSC analizados (es decir, después de la sustracción de línea de base y ajuste de curvas). La línea azul representa el termograma después de la sustracción de línea de base, mientras que la línea roja representa la curva con el mejor ajuste a la termograma. (A) El T m? H y para la proteína 1 Muestra # 12 son 80,16 ° C y 1,69 x 10 6 cal / mol, respectivamente. (B) La Tm y? H de la proteína 1 Muestra # 13 son 80,15 ° C y 1,71 x 10 6 cal / mol, respectivamente. (C) La Tm y? H de la proteína 2 Muestra # 21 son 75,01 ° C y 4,08 x 10 6 cal / mol, respectivamente. (D) La Tm y? H de la proteína 2 Muestra # 22 son 75,67 ° C y 4,22 x 10 6 cal / mol, respectivamente. Por favor, haga clic aquí paraver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Un termograma incompleta. recogen los datos en bruto para la proteína 1 analizada en un rango de temperatura inadecuada. La temperatura final de experimento se estableció a 90 ° C que no acomodar todo el perfil de transición de la proteína en comparación con el experimento de la Figura 2A que se estableció a 120 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: analizaron los datos que muestran el efecto de la Química desintoxicación en la estructura terciaria de la proteína 1. (A) Proteína 1 es una toxina en su conformación nativa y has su Tm en 56.84 ° C y? H a 2,57 x 10 5 cal / mol. (B) La forma destoxificada de la proteína 1 (es decir, toxoide) tiene T valores? H de 81,01 ° C y m y 1,89 x 10 6 cal / mol, respectivamente. Por lo tanto, se puede concluir que la etapa de desintoxicación introdujo alguna forma de variación de la conformación estructural de la proteína 1 que confiere una mayor estabilidad (mayor T m) a su forma destoxificada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: analizaron los datos que muestran el efecto de las condiciones de almacenamiento en la conformación de la proteína 3. Estos gráficos ilustran el efecto de la temperatura de almacenamiento (2 – 8 ° C) sobre la estabilidad y la estructura terciaria de ProTein 3 más de 30 semanas. Los valores de? H de la proteína 3 al 8 de (A) y 38 semanas TH (B) de almacenamiento T m y se dan en la Tabla 1 a continuación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Muestra Tm 1 (° C) ? H 1 (cal / mol) Tm 2 (° C) ? H 2 (cal / mol) Tm 3 (° C) ? H 3 (cal / mol) Proteína 3 almacenado a 2-8 ° C durante 8 semanas 61.91 1,71 x 10 5 75.54 2,17 x 10 5 90.29 4,17 x 10 5 <td> Proteína 3 almacenado a 2-8 ° C durante 38 semanas 61.87 1,66 x 10 5 75.18 1,46 x 10 5 90.22 5,76 x 10 5 Tabla 1: Tm y? H Los valores de proteína 3 en la 8ª y 38ª semana de almacenamiento a 2 – 8 ° C. Aunque los valores m T en ambos puntos temporales son similares, la diferencia en los valores de? H indica que la estructura terciaria de la proteína 3 se ha degradado más de 30 semanas bajo la condición de almacenamiento especificado.

Discussion

Este procedimiento se ha incorporado con éxito en varios módulos de ensayo de caracterización, incluyendo estudios de estabilidad y de comparabilidad de productos ^21. En los estudios de estabilidad en tiempo real, DSC se utiliza para supervisar la T _m, así como estimar el F _una de biológicos a través del tiempo para determinar su vida útil. Con respecto a la comparabilidad de producto, se utiliza para evaluar el impacto de proceso y el cambio instalación, así como el efecto de etapas de fabricación clave en la conformación estructural de los lotes producidos. Normalmente, esto implica la comparación directa de la? H del lote producido a un producto de referencia que ha sido designado como el producto ideal. Además, DSC ha demostrado ser una herramienta analítica útil para los estudios de formulación de productos ^37. La _Tm de una proteína en diferentes tampones y a diferentes concentraciones se puede utilizar para determinar la formulación que me ofrece la mayor estabilidad ala proteína.

Para garantizar la fiabilidad de este método y la objetividad de sus resultados, es importante mantener los parámetros de pruebas consistentes de una ejecución a otra dentro del mismo estudio (por ejemplo, la vacuna del estudio de formulación). Sin embargo, el procedimiento puede ser modificado para acomodar las diferencias en las propiedades físicas de varias proteínas. Un ejemplo de una modificación que puede hacerse está alterando la velocidad de exploración del experimento ^{^38,} ^39. Las proteínas que eran propensos a los agregados que forman cuando se calienta se examinaron a una velocidad de exploración más rápido (por ejemplo, 120 ° C / h) para evitar la contribución de los agregados con el perfil de transición térmica, así como la obstrucción de los capilares del calorímetro. Vale la pena señalar que la tasa de exploración puede influir en el resultado de un experimento de DSC ^38. Ensanchamiento del pico de transición térmica se ha observado con el aumento de las tasas de exploración de alguna proproteínas; Sin embargo, _{la Tm} se mantuvo bastante constante ^38. Además, las etapas de diálisis y de desgasificación para la preparación de muestras también son muy crucial para obtener resultados precisos ^31. La diálisis se asegura de que la única diferencia en la composición de la muestra y el tampón es la proteína; Por lo tanto, todo el exceso de calor absorbida por la muestra se puede atribuir a la capacidad térmica de la proteína. Desgasificación asegura análisis volumen preciso, como la extrapolación del parámetro termodinámico asume que el evento despliegue está ocurriendo bajo volumen y la presión ³¹ constante. La parte de la presión constante de la hipótesis se explica por la presurización de nitrógeno del sistema de acuerdo con la sección 1.1 del procedimiento.

En comparación con otros métodos para determinar la estabilidad de conformaciones de las proteínas tales como dicroísmo circular (CD) y la fluorescencia Espectroscopias, DSC ofrece una serie de ventajas en un comentorno comercial incluyendo el ahorro de costes y tiempo. En primer lugar, el diseño adiabático de un calorímetro de exploración diferencial permite la medición de la estabilidad térmica con mayor precisión la temperatura en comparación con las mediciones con instrumentación para CD y fluorescencia Espectroscopias ^6. En segundo lugar, a diferencia de CD, la exactitud de los datos de DSC no es dependiente de la helicidad de la proteína de ^{^39,} ^40; Sin embargo, CD proporciona información adicional sobre el despliegue de la estructura secundaria, que sería complementario al DSC ^41. Además, la presurización del sistema DSC permite el ensayo con una amplia gama de temperaturas sin hervir la muestra; Por lo tanto, una amplia gama de proteínas puede ser probada por DSC.

Mientras DSC es un método relativamente rápido y directo para determinar la estabilidad térmica de los productos biológicos, no es sin limitaciones. En primer lugar, la basepaso línea de sustracción introduce algún tipo de inconsistencia humana en el análisis de los datos en bruto; por lo tanto, las variaciones en los resultados pueden ser observados entre los diferentes usuarios. En segundo lugar, calorímetros diferenciales de exploración tienen límites mínimos de concentración que podría ser difícil de lograr a escala de fabricación a granel. En tercer lugar, la? H de la desnaturalización térmica irreversible no es absoluta; lo que implica que Delta G derivado (un indicador de la estabilidad de la proteína) en escenarios similares puede ser engañosa. Además, el método funciona mejor para muestras purificadas. Presencia de impurezas puede o bien causar un cambio en la T _m si existe una interacción con la proteína objeto de la investigación, o aparición de nuevas transiciones térmicas si no hay interacción. En cualquier caso, estas características adicionales en los termogramas se pueden atribuir erróneamente a las muestras, lo que afecta a la interpretación de los resultados. A pesar de estas limitaciones, DSC sigue siendo un método confiable que puede proporcionar información detallada sobre termodinámica THe proteína proceso que tiene lugar si se aplica adecuadamente ^42.

En conclusión, DSC ofrece considerable ventaja como una herramienta de lectura conformacional para productos de la vacuna y sus intermedios. Los dos parámetros, _Tm y? H, recogidos para una serie de lotes del mismo producto pueden llegar a ser una línea de base empírica que se puede utilizar para examinar el impacto de los cambios en el proceso, la formulación y las condiciones de almacenamiento en la estructura terciaria y la estabilidad de la proteína y antígenos virales ^{^21,} ^43.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores están muy agradecidos a José Mancini (anteriormente con GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments Limited) por su papel en la instalación y la formación en el calorímetro diferencial de barrido, Sasmit Deshmukh y Webster Magcalas por sus discusiones.

Materials

Differential Scanning Calorimeter	Malvern Instruments Ltd	28428948 (Via GE Healthcare)	Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Dilute with water to 20% before use
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate	Canadian Life Science	ML072100	Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet	Labconco	Logic+ – A2	biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette	Thermo Scientific	66810 or 66380	to equilibrate the sample and buffer

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Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).