Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Ibrahim B. Durowoju; Kamaljit S. Bhandal; Jian Hu; Bruce Carpick; Marina Kirkitadze

doi:10.3791/55262

JoVE Journal > Biochemistry

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생화학

Calorimétrie différentielle à balayage - une méthode d'évaluation de la stabilité thermique et la Conformation de Protein Antigen

Published: March 04, 2017

doi:

10.3791/55262

Ibrahim B. Durowoju¹, Kamaljit S. Bhandal¹, Jian Hu¹, Bruce Carpick¹, Marina Kirkitadze¹

¹Analytical Research & Development,Sanofi Pasteur Limited

Summary

La calorimétrie différentielle mesure la température de transition thermique (s) et de l'énergie thermique totale requise pour dénaturer une protéine. Les résultats obtenus sont utilisés pour évaluer la stabilité thermique des antigènes protéiques dans des formulations de vaccins.

Abstract

La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une technique analytique qui mesure la capacité calorifique molaire d'échantillons en fonction de la température. Dans le cas d'échantillons de protéines, les profils DSC fournissent des informations sur la stabilité thermique, et dans une certaine mesure, sert de «empreinte digitale» de structure qui peut être utilisée pour évaluer la conformation structurelle. Elle est réalisée à l' aide d' un calorimètre différentiel à balayage qui mesure la température de transition thermique (température de fusion, T _m) et l'énergie nécessaire pour rompre les interactions de stabilisation de la structure tertiaire (enthalpie, AH) des protéines. Des comparaisons sont faites entre les formulations ainsi que des lots de production, et les différences de valeurs dérivées indiquent des différences dans la stabilité thermique et la conformation structurelle. Les données illustrant l'utilisation de DSC dans un cadre industriel pour les études de stabilité, ainsi que le suivi des étapes clés de la fabrication sont fournis comme preuve de l'efficacité de cette protocol. Par rapport aux autres méthodes d'évaluation de la stabilité thermique des conformations de protéines, DSC est rentable, nécessite peu d'étapes de préparation des échantillons et fournit également un profil thermodynamique complet du processus qui se déroule de la protéine.

Introduction

Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une méthode expérimentale , qui mesure directement la différence dans l' absorption d'énergie thermique ayant lieu dans un échantillon par rapport à une référence lors d' un changement régulé en température ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ^{^8,} ⁹ ^, ^{^10,} ^{^11,} ^12. Effectué dans un calorimètre différentiel à balayage, le procédé consiste à introduire l' énergie thermique dans une cellule échantillon et une cellule de référence , tout en augmentant simultanément la température à l' identique des deux cellules au cours du temps ^{^2,} ^{^13,}14. En raison de la différence dans la composition de l'échantillon et la référence, la quantité d'énergie différente sera nécessaire pour élever la température des cellules ^{^2,} ^{^12,} ^13. Ainsi, la quantité excessive d'énergie nécessaire pour compenser la différence de température entre les cellules est mesurée et directement corrélée à des propriétés thermodynamiques spécifiques de l'échantillon ^{^1,} ^3.

Dans les années 1960, MJ O'Neil et E. Watson de Perkin Elmer développé le premier calorimètre différentiel pour mesurer le flux de chaleur de matériaux solides ^{^2,} ^{^3,} ^4. En parallèle, PL Privalov et DR Monaseldze EL de l'Institut de Physique, République de Géorgie (ex-URSS) ont créé un calorimètre différentiel adiabatique unique qui peut être utilisé for la recherche biochimique ^{^5,} ^6. Par la suite, l'équipe de Andronikashvili à l'Institut de Physique, République de Géorgie, a rapporté la capacité thermique de biomolécules telles que les protéines fibreuses et globulaires, l' ADN et l' ARN en utilisant DSC ^{^7,} ^{^8,} ^9. Plusieurs équipes dirigées par Sturtevant ^{^10,} ^{^11,} ^12, ¹³ Brandts et Privalov ^{^14,} ^{^15,} ¹⁶ concentrés sur le développement de la théorie et les applications pratiques de DSC pour étudier les détails thermodynamiques de dépliement des protéines. La valeur de DSC dans l' étude des grandes structures supramoléculaires tels que les phages, les chloroplastes, les cristaux liquides phospholipides et des protéines de la viande ont également été signalés ¹⁷ </ ^sup>, ^{^18,} ^{^19,} ^20.

DSC est devenu monnaie courante dans la recherche et le développement pharmaceutique pour l'évaluation de la stabilité thermique des biomolécules, en particulier des protéines ^{^1,} ^{^21,} ^22. Cela est principalement dû à des progrès en termes de sensibilité et de l' automatisation de l'instrumentation utilisée pour réaliser l'expérience ^{^23,} ^24. Ici, le résultat final de l'expérience de DSC, à savoir, la capacité thermique molaire en fonction de la température, est utilisée pour estimer les paramètres thermodynamiques suivants (changement de capacité thermique (ΔCp), enthalpie (AH), l'entropie (ΔS) et énergie libre de Gibbs (AG)) en utilisant l'équation ci-dessous:

eq1.jpg "/> (1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Où Cp est mesurée la capacité thermique; q est le flux de chaleur dans le matériau d'essai; T ₀ et T sont les températures initiales et finales de la transition , respectivement ^{^22,} ^25. Il est également intéressant de noter que les équations applicables ci – dessus pour les protéines à domaine unique qui peuvent subir la transition à deux états et réversible dépliement thermique ^22. L' analyse des protéines plus complexes (par exemple des protéines, deux à l' état non, et oligomères) have été rapporté par Friere et al. ^26; Johnson et al. ^27; et Kasimova et al. ^28.

Pour déterminer si une protéine subit une transition à deux états ou forme intermédiaires lors de la dénaturation thermique, l'enthalpie expérimentalement (AH; aussi appelé enthalpie comme calorimétrique AH _Cal) est comparé à l'enthalpie dérivée en utilisant l'équation de van't Hoff donnée ci – dessous (également dénommée van't Hoff enthalpie; AH _VH):

(6)

Où T _m est la température de point médian de la transition, R est la constante des gaz parfaits (1,987 cal mol ^-1 K ^-1) et Y est la fraction de la population de protéines à l'état déplié ^{^16,} ^29. SiAH _VH est égal à AH _Cal; ou AH _VH / AH _Cal est égal à 1, alors la protéine subit un "tout ou rien" transition (ie de transition à deux états) ^{^16,} ^{^25,} ^29. Cependant, si AH _VH est inférieure à AH _Cal; ou AH _VH / AH _Cal est inférieur à 1, la protéine subit une transition à deux états non ^{^16,} ^{^25,} ^29. Le rapport de _VH AH / AH _Cal correspond également à la proportion de la structure de la protéine qui fond comme une unité ou d'un domaine coopératif ²⁶ thermodynamique.

Les paramètres thermodynamiques tels que mentionnés ci-dessus, et Ag AH fournissent des informations utiles quant à la stabilité thermique des protéines, y compris des produits biologiques ^30. Cependant, l' accent sera mis sur T _m et AH dans cette publication, car ils sont les valeurs déclarées pour ce protocole. T _m est la température à mi-parcours de la transition, où le pliage et les états dépliés de la protéine sont à l' équilibre (ie, AG = 0) ^{^25,} ^31. Plus la _Tm d'une protéine, plus sa stabilité thermique ^31. AH correspond à la surface sous le pic (s) de la capacité de chaleur par rapport à la courbe de température (également connu sous le thermogramme) généré à la fin de l'expérience DSC ^{^16,} ^25. Il est l'énergie requise pour dénaturer les protéines et peut être utilisée pour estimer la fraction active (F _a) dans une formulation de protéine ( par exemple, la proportion de protéines ayant une conformation active dans un échantillon) en utilisant l'équation suivante:

jove_content ">

(7)

Où AH est l'enthalpie obtenu de façon expérimentale de l'échantillon de protéine et Q est l'enthalpie calculée pour une référence bien caractérisé normalisée ou d'une protéine ^22. L'estimation de F _a est importante pour la surveillance de la stabilité en temps réel des produits ainsi que la réalisation d' études de stabilité dans des conditions de stress tel que requis par les lignes directrices de l' ICH ^32. Comparaison de AH fournit également des informations sur la compacité de la structure tertiaire de conformation d'une protéine ^31.

Ce protocole décrit en détail une procédure d'évaluation de la stabilité thermique des protéines dans un milieu industriel et a été largement utilisé pour la formulation de vaccins. Il a été développé en utilisant un calorimètre différentiel à balayage automatisé qui génère des résultats reproductibles fou des concentrations aussi faibles que 300 pg / ml de protéine.

Protocol

1. Instrument Start-up Mettre en marche le calorimètre différentiel à balayage et à augmenter la pression dans les cellules à supprimer l'ébullition des échantillons, ainsi que d'éviter la formation de bulles à des températures élevées. Cette opération est généralement réalisée par apport de l'azote dans le système. En fonction du matériau constitutif de la cellule (par exemple, le tantale, l' or, le platine, etc.), régler la pression de l'alimentation en gaz d'azote selon la pression recommandée par le fabricant pour éviter d' endommager la cellule. Par exemple, régler la pression de l'alimentation en azote gazeux à 45 psi pour l'instrument utilisé pour développer cette procédure, et la pression supérieure à 80 psi peut endommager la cellule. Veiller à ce que tous les réservoirs d'agent de nettoyage sont remplis au volume requis. Les agents de nettoyage nécessaires comprennent un détergent et de l'eau pour laver et nettoyer la cellule, respectivement, après chaque échantillon run. Régler la température du compartiment de retenue d'échantillonà une valeur appropriée, de préférence de 5 ° C, pour maintenir l'intégrité de l'échantillon avant l'expérimentation. Préparation 2. Sample Dialyser l'échantillon contre le tampon qui sera utilisé comme référence pour l'expérience. En variante, le tampon d'élution ont été recueillies à l'étape finale de la purification des protéines ( par exemple la colonne d' élution) peut être utilisée. Déterminer la concentration de l'échantillon de protéine en utilisant la méthode de détermination de la concentration en protéines plus convenable tel que le procédé Kjedahl 33 ou 34 méthode de Lowry. A titre de comparaison objective des résultats, utilisez la même méthode cohérente dans la même étude. La plage de concentration requise peut varier en fonction du modèle de l'instrument. Pour l'instrument utilisé dans ce protocole, la plage de travail est préférable de 0,5 à 1 mg / mL. Dégazer le tampon d'échantillon et de référence dans le vide pour se débarrasser de microbulles qui peuvent causer le volume inaccurAcy. Cette étape peut être ignorée pour les modèles plus récents calorimètre. En utilisant une micropipette et embouts stériles dans une armoire de bioconfinement à flux laminaire, charger les échantillons et leur tampon respectif par paires en plaques à 96 puits compatibles avec l'instrument. Remplir les deux premières paires de puits avec le tampon et les deux dernières paires avec de l'eau pour le tampon et le tampon d'analyse de l'eau, respectivement. Balayages Buffer-tampon de vérifier l'adéquation de l'instrument avant la mesure (évaluation de l' erreur d'instrumentation) échantillonner ainsi que d' établir une ligne de base; tandis que les analyses d'eau sont exécutés pour nettoyer les cellules. Couvrir la plaque de 96 puits avec un film d'étanchéité, et de veiller à ce que les puits soient bien étanches avant de prendre la plaque hors du Cabinet de biosécurité pour éviter la contamination de l'échantillon. Placer la plaque dans l'échantillon de maintien compartiment dans le bon sens. Configuration 3. Experimental Paramètre Remarque: Selon le instrumentation, des échantillons peuvent être chargés dans la cellule, soit manuellement à l'aide d'une seringue, ou automatiquement en utilisant un échantillonneur automatique. Dans ce cas (ie un milieu industriel), un échantillonneur automatique est utilisé pour gagner du temps. Utilisation du logiciel d'acquisition, entrez l'information d'échantillon dans l'ordre de la plaque a été chargé conformément à la section 2.4. Entrez les concentrations si disponible, sinon, entrez les valeurs de concentration dans le logiciel d'analyse avant l'analyse des données (section 4.2). Sélectionnez l'option qui assure le nettoyage des cellules avec un détergent avant chaque analyse d'échantillon, qui devrait être suivie par plusieurs étapes de rinçage à l'eau pour assurer qu'aucun résidu de détergent est laissé dans les cellules. Régler la température de départ de l'essai à 20 ° C, mais cela peut varier en fonction de la connaissance préalable de l'échantillon. Pour des protéines connues, la température de départ prédéterminée peut être utilisé, tandis qu'une température de départ inférieure peut être appliquée pour des échantillons inconnus. Réglez la température finalede l'expérience, par exemple 100 ° C. La température finale peut varier en fonction de la connaissance préalable de l'échantillon. Réglez la vitesse de balayage de l'expérience, par exemple 60 ° C / h, ce qui est la vitesse de balayage typique. Cependant, la vitesse de balayage peut varier en fonction de la connaissance préalable de l'échantillon, par exemple 90 ° C / h, ou 120 ° C / h. Il est conseillé de scanner des échantillons inconnus à différentes vitesses de balayage pour évaluer la cinétique de dépliage. échantillons Rescan pour étudier la réversibilité du dépliement thermique. Le déroulement d'une protéine est considérée comme réversible si l'enthalpie obtenue pour le deuxième balayage est d'au moins 80% de la valeur d'enthalpie pour la première analyse. Régler le thermostat après l'essai à 10 ° C pour préserver l'intégrité des cellules du calorimètre. Vérifiez que les paramètres de configuration de l'expérience sont correctes avant d'exécuter l'expérience. Si tout est en place, commencer l'expérience. 4. Les données Unealy Récupérer les données brutes de l'expérience et de sélectionner un échantillon à la fois pour l'analyse. Scan Soustraire de référence, c. -à- tampon, de l'analyse de l' échantillon. NOTE: Référence soustraction est effectuée automatiquement par les nouveaux modèles d'instruments de DSC. Entrer la valeur de concentration échantillon si elle a été omise conformément à l'article 3.1. Monter et soustraire la ligne de base de la thermogramme acquise pour tenir compte des différences dans les capacités thermiques des Etats pliée et dépliée de la protéine qui est causée par l'exposition des groupes hydrophobes à l'eau lors de dépliage. Linéaire ou cubique d'ajustement de courbe peuvent être appliqués en fonction de la forme du profil de DSC pour l'échantillon. Par souci de cohérence, le même type de montage doit être utilisé au cours d' une étude, par exemple , l' étude de stabilité en temps réel. Cette étape est nécessaire pour traiter la courbe d'intégration de pointe pour obtenir enthalpie de transition. Effectuer l'intégration de pointe à l'aide non-linéaire moindres carrés. Basé sur le produitconnaissances appliquer deux états ou modèle à deux états non. Le modèle à deux états peut être utilisé pour un seul transitions thermiques coopératives, et pour des protéines inconnues, appliquer deux non modèle d'état jusqu'à ce que de nouvelles connaissances de produit est disponible. Le cas échéant, ajuster ajustement de courbe en utilisant la courbe fonction d' ajustement itérative du logiciel de l'équipement jusqu'à ce que la valeur du chi carré reste constante. Les résultats obtenus montreront les valeurs de milieu de températures de transition (Tm), enthalpie calorimétrique (AH), et van't Hoff enthalpie (AH VH) de l'échantillon.

Representative Results

Les données brutes de la plupart des expériences de DSC sont présentés sous forme d' un flux de chaleur par rapport à la courbe de température, que le calorimètre mesure en fait la différence entre la vitesse d'écoulement de chaleur dans la solution d'échantillon et de tampon 35. Par conséquent, si les deux cellules (ie cellules d'échantillon et de référence) contiennent des solutions identiques lors d' une expérience, les données brutes de l'analyse devraient être une ligne à plat , avec des pics observables. Tout pic observé peut être attribué à une erreur d'instrumentation (cellules par exemple endommagés ou contaminés), ce qui explique pourquoi l' exécution d' analyses de tampon analyse préalable à l' échantillon est une épreuve suffisante de conformité du système. La figure 1 illustre le résultat d'une analyse de la mémoire tampon typique indiquant que le calorimètre était en bon état de fonctionnement avant l'analyse des échantillons. La figure 2 montre les données brutes d'une expérience DSC effectuée sur diffbeaucoup érents de deux échantillons de protéines. Comme il ressort plus haut, les pics observés sont les différences dans le flux de chaleur des échantillons et leurs tampons respectifs. Les différences de concentration de l'échantillon peuvent provoquer des variations de capacité calorifique enregistré par le calorimètre; Cependant, ces variations sont normalisées lors de l'analyse de l'échantillon conformément à l'article 4.2 de la procédure. Des concentrations plus élevées peuvent également révéler des domaines thermodynamiques supplémentaires ne contribuent pas à la transition à des concentrations plus faibles. En outre, chaque transition représente un domaine thermodynamique qui peut comprendre un ou plusieurs domaines structuraux de la protéine 36. Dans ce cas, la protéine 1 a trois domaines structuraux qui se fondent en coopération. La figure 3 montre les résultats obtenus à partir de l'analyse des données brutes pour les protéines 1 et 2 présentés dans la figure 2, à savoir, après soustraction de base et itératif courbe fiPrép. Les thermogrammes obtenus ont été normalisées pour la numérisation de taux (automatiquement effectué par un algorithme prédéfini dans le logiciel d'analyse) et de la concentration; Ainsi, la présentation des résultats de l'expérience de la capacité calorifique comparable par rapport à des graphes de température. Le logiciel d'analyse utilise les données de la capacité calorifique par rapport à des graphiques de température, tels que T m et ΔCp, pour dériver d' autres paramètres thermodynamiques utilisant des variations des équations données ci – dessus en fonction de la coopérativité de dépliement des protéines. Lors du test des échantillons inconnus, le réglage de la plage de température appropriée est cruciale. Dans le cas contraire, les thermogrammes incomplètes peuvent en résulter, comme cela est illustré sur la figure 4. Bien que T m à partir de ces profils peut être dérivée, AH ne peut pas être déterminée avec précision. Par conséquent, l'échantillon doit être retesté avec une plus grande plage de température pour saisir complètement la transition thermique. Certaines protéines re aussiforme adily agrégats après dénaturation complète, résultant en une augmentation de la capacité thermique post-transition: apparaît souvent comme un thermogramme incomplet comme illustré sur la figure 2B. Cependant, un nouvel essai avec une température finale plus élevée peut permettre de confirmer l'existence d'une occurrence d'une transition conformationnelle dans cette région du thermogramme ou il est que l'effet d'absorption de la chaleur des agrégats de protéines. La stabilité thermique est l' une des propriétés physiques les plus importantes de protéines et de produits à base de protéines dans l'industrie 37. Dans le domaine pharmaceutique, il est utilisé pour déterminer la stabilité des produits biologiques dans des conditions différentes, y compris des tampons de formulation et des facteurs environnementaux tels que l'humidité et la température. Il est également utilisé pour surveiller la clé étape de fabrication (par exemple, la purification et la désintoxication) pour assurer la cohérence conformationnelle entre les lots de production. <strong > Les figures 5 et 6 illustrent l'utilisation de DSC pour examiner les effets des conditions de désintoxication et de stockage de produits chimiques , respectivement sur la stabilité et la conformation structurelle de deux protéines différentes. Les différences significatives dans Tm et AH indiquent des changements conformationnels et la dégradation des protéines, respectivement. En outre, la perte de la troisième transition de la figure 6 illustre en outre la dégradation d'un domaine qui a été confirmé par une diminution du poids moléculaire , lorsque les échantillons ont été analysés en utilisant des tailles de chromatographie d' exclusion par diffusion de lumière multi-angles (SEC-MALS) ( données non présentées). Figure 1: Buffer Scans. La similitude de gradient de chaque balayage, sans pics observables indique que l'appareil est en bon état de fonctionnement et a généré des résultats reproductibles.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Les données brutes recueillies à partir des expériences de DSC. Ces graphiques sont bonnes représentations des données non analysées (brutes) acquis après essais expérimentaux (ie avant soustraction de base et l' ajustement de courbe). Chaque ligne représente un lot de production. Protein 2 tend à regrouper plus facilement lors du chauffage, ce qui entraîne une augmentation de la capacité thermique supérieure à 100 ° C dans la région post-transition du thermogramme. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <br/> Figure 3: Analyse DSC données. Ces graphiques sont bonnes représentations de données DSC analysées (après soustraction de base et ajustement de la courbe). La ligne bleue représente le thermogramme après soustraction de base, tandis que la ligne rouge représente la courbe avec le meilleur ajustement à la thermogramme. (A) La Tm pour les protéines et AH 1 Echantillon n ° 12 sont 80,16 ° C et 1,69 x 10 6 cal / mol respectivement. (B) Le T m et AH pour Protein 1 Echantillon n ° 13 sont 80,15 ° C et 1,71 x 10 6 cal / mol respectivement. (C) La Tm pour les protéines et AH 2 Echantillon n ° 21 sont 75,01 ° C et 4,08 x 10 6 cal / mol respectivement. (D) La Tm pour les protéines et AH 2 Echantillon n ° 22 sont 75,67 ° C et 4,22 x 10 6 cal / mol respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pourvoir une version plus grande de cette figure. Figure 4: Un thermogramme incomplet. Les données brutes pour recueillir Protein 1 analysé à une plage de température insuffisante. La température finale de l' expérience a été réglée à 90 ° C , qui n'a pas tenu compte du profil de la transition complète de la protéine par rapport à l'expérience de la figure 2A qui a été réglée à 120 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5: a analysé les données montrant l'effet de détoxification chimique sur la structure tertiaire de la protéine 1. (A) Protein 1 est une toxine dans sa conformation native et has son T m à 56,84 ° C et AH à 2.57 x 10 5 cal / mol. (B) La forme détoxifiée de Protein 1 (c. -à- tétanique) a respectivement T m et les valeurs ÔH de 81,01 ° C et 1,89 x 10 6 cal / mol. Ainsi, on peut conclure que l'étape de désintoxication introduit une certaine forme de variation de la conformation structurelle de la protéine 1 qui confère une plus grande stabilité (supérieure T m) à sa forme détoxifiée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 6: a analysé les données montrant l'effet des conditions de stockage sur la Conformation des protéines 3. Ces graphiques illustrent l'effet de la température de stockage (2 – 8 ° C) sur la stabilité et la structure tertiaire de ProTein 3 plus de 30 semaines. La Tm et les valeurs ÔH pour la protéine 3 au 8 ème (A) et 38 ème semaine (B) de stockage sont donnés dans le tableau 1 ci – dessous. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Échantillon Tm 1 (° C) AH 1 (cal / mol) 2 Tm (° C) AH 2 (cal / mol) 3 Tf (° C) AH 3 (cal / mol) Protein 3 stocké à 2-8 ° C pendant 8 semaines 61,91 1,71 x 10 5 75,54 2,17 x 10 5 90.29 4,17 x 10 5 <td> Protein 3 stocké à 2-8 ° C pendant 38 semaines 61.87 1,66 x 10 5 75.18 1,46 x 10 5 90.22 5,76 x 10 5 Tableau 1: Tm et ÔH valeurs pour Protein 3 au 8 e et 38 e Semaine de stockage à 2 – 8 ° C. Bien que les valeurs de Tm des deux points de temps sont les mêmes, la différence entre les valeurs de ÔH indique que la structure tertiaire de la protéine 3 a dégradé de plus de 30 semaines dans les conditions de stockage spécifiées.

Discussion

Cette procédure a été intégrée avec succès dans divers paquets d'essai de caractérisation, y compris la stabilité et la comparabilité des produits ²¹ études. Dans les études de stabilité en temps réel, DSC est utilisée pour surveiller la _Tm, ainsi que d' estimer la F _a des agents biologiques au fil du temps pour déterminer leur durée de vie. En ce qui concerne la comparabilité des produits, il est utilisé pour évaluer l'impact des processus et le changement de l'installation ainsi que l'effet des étapes clés de la fabrication sur la conformation structurelle des lots produits. Cela implique généralement la comparaison directe de l'AH du lot produit à un produit de référence qui a été désigné comme le produit idéal. En outre, DSC a révélé être un outil d' analyse utile pour les études de formulation de produit ^37. La _Tm d'une protéine dans différents tampons et à des concentrations différentes peuvent être utilisées pour déterminer la formulation la plus grande stabilité profère àla protéine.

Pour assurer la fiabilité de cette méthode et de l' objectivité de ses résultats, il est important de garder les paramètres de test cohérente d' une exécution à l' intérieur de la même étude (par exemple, le vaccin contre l' étude de formulation). Toutefois, la procédure peut être modifiée pour tenir compte des différences dans les propriétés physiques des diverses protéines. Un exemple d'une modification qui peut être apportée modifie le taux de l'expérience ^{^38,} ³⁹ balayage. Les protéines qui ont été exposées à des agrégats qui forment lorsqu'ils sont chauffés ont été examinés à une vitesse de balayage plus rapide (par exemple, 120 ° C / h) afin d' éviter l'apport de granulats à profil de transition thermique ainsi que d' obstruer les capillaires du calorimètre. Il est intéressant de noter que la numérisation taux peut influencer le résultat d'une expérience de ³⁸ DSC. L'élargissement du pic de transition thermique a été observée avec l'augmentation des taux de balayage dans certains protéines; cependant, T _m est resté relativement constant ^38. En outre, les dialyse et de dégazage étapes de préparation des échantillons sont également très important pour des résultats précis ^31. La dialyse assure que la seule différence dans la composition de l'échantillon et le tampon est la protéine; Ainsi, tout l'excès de chaleur absorbée par l'échantillon peut être attribuée à la capacité thermique de la protéine. Dégazage assure l' analyse du volume précis, comme l'extrapolation du paramètre thermodynamique suppose que l'événement se déroule soit produit dans le volume et la pression ³¹ constante. La partie de la pression constante de l'hypothèse est comptabilisée par mise sous pression d'azote du système conformément à l'article 1.1 de la procédure.

En comparaison à d'autres méthodes de détermination de la stabilité des conformations de protéines telles que dichroïsme circulaire (CD) et Fluorescence spectroscopies, DSC offre un certain nombre d'avantages dans un comcadre commercial, y compris des économies de coûts et de temps. En premier lieu, la conception adiabatique d'un calorimètre différentiel à balayage permet la mesure de la stabilité thermique avec une meilleure précision de la température par rapport aux mesures effectuées avec l' instrumentation pour CD et spectroscopies de fluorescence ^6. D' autre part, contrairement aux CD, la précision des données de DSC ne dépend pas de l'hélicité de la protéine ^{^39,} ^40; Toutefois, CD fournit des informations supplémentaires sur le déroulement de la structure secondaire, qui serait complémentaire du DSC ^41. En outre, la mise sous pression du système DSC permet de tester une large gamme de températures sans faire bouillir l'échantillon; Ainsi, une large gamme de protéines peut être testée par DSC.

Bien que DSC est une approche relativement simple et rapide pour déterminer la stabilité thermique des produits biologiques, il est pas sans limites. Tout d'abord, la baseétape en ligne de soustraction introduit une certaine forme d'incohérence humaine dans l'analyse de données brutes; ainsi, les variations dans les résultats peuvent être observées entre les différents utilisateurs. Deuxièmement, différentielles calorimètres de balayage ont des limites de concentration minimales qui pourraient être difficiles à réaliser à l'échelle industrielle en vrac. Troisièmement, l'AH de dénaturation thermique irréversible est pas absolue; ce qui implique que Ag dérivé (un indicateur de la stabilité des protéines) dans des scénarios similaires peut être trompeur. En outre, le procédé fonctionne le mieux pour des échantillons purifiés. La présence d'impuretés peut soit provoquer un déplacement de la _Tm en cas d'interaction avec la protéine à l'étude, ou l' apparition de nouvelles transitions thermiques s'il n'y a pas d' interaction. En tout cas, ces fonctionnalités supplémentaires sur les thermogrammes peuvent être attribués à tort des échantillons, affectant ainsi l'interprétation des résultats. Malgré ces limites, DSC reste une méthode fiable qui peut fournir des informations détaillées au sujet de thermodynamique thprotéine e processus en cours si elles sont appliquées correctement ^42.

En conclusion, DSC offre un avantage considérable comme un outil de lecture conformationnelle pour les produits de vaccin et leurs intermédiaires. Les deux paramètres, T _m et AH, collectées pour un tableau de lots d'un même produit peuvent devenir une base empirique qui peut être utilisé pour examiner l'impact des changements de processus, la formulation, et les conditions de stockage sur la structure tertiaire et la stabilité des protéines et les antigènes viraux ^{^21,} ^43.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs sont très reconnaissants à Joseph Mancini (anciennement GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments limitée) pour leur rôle dans l'installation et la formation sur le calorimètre différentiel, Sasmit Deshmukh et Webster Magcalas pour leurs discussions.

Materials

Differential Scanning Calorimeter	Malvern Instruments Ltd	28428948 (Via GE Healthcare)	Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Dilute with water to 20% before use
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate	Canadian Life Science	ML072100	Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet	Labconco	Logic+ – A2	biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette	Thermo Scientific	66810 or 66380	to equilibrate the sample and buffer

References

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Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).