母親の遺伝子産物の機能操作の使用<em>インビトロ</emゼブラフィッシュにおける>卵成熟

関連する国内および/または地域の動物福祉団体によって定義されているすべてのゼブラフィッシュは、優れた動物の練習に厳密に従って処理された、そしてすべての動物の作業は、適切な委員会（ウィスコンシン大学マディソン保証番号A3368-01の大学）によって承認されました。動物は26.5℃で、標準的な条件下で維持しました。 女性の1.事前選択注：卵母細胞は、成人女性では一般的に、ステージIからVに、発達段階の範囲に及ぶ（ 図2）。新しく開発した卵母細胞は、コホート3、14のように見えるとして成功した自然交配を通じて既存の卵母細胞のメスをパージすると、卵母細胞ステージングの同期を向上させます。約8日後にパージの中で、最も卵母細胞は、インビトロ成熟の開始のために最適な初期段階IV、です。そのような同期化は、卵母細胞のTHAの収率を増加させますtは、実験操作を容易に、 体外成熟の完全なプロセスを経ることができます。一対の交配及び魚水組成物（ここで魚の設定の詳細については以前の記述13を参照して、海の塩14gのと逆浸透水1000リットルあたりのNaHCO 3を150g、pHが6.5〜8.5（好ましい範囲：6.8 -7.5）及び180から360μSの導電率）。ブランドらを参照してください。追加のレシピのための13。 8〜10日には、in vitro培養操作に先立って、相手側のタンクに所望の歪みのシングル男性とシングル女性の魚を転送するために魚のネットを使用しています。複数のセットをペア。一晩の交配タンクでそれらを残します。彼らは夜の間に、次の日の午後を通じて交尾できるようにします。 交尾中に卵を得メスを分離し、別のタンクにそれらを配置するために、魚のネットを使用してください。食品の混合物で2回毎日これらの女性をフィードcontainiブラインシュリンプと魚の餌フレークのほぼ等しい量をngの。食べ物の量は、供給時間の約20分ではなく、より多くを、提供するのに十分でなければなりません。 成熟培地の調製注：女性から卵母細胞を除去するための1時間以内に、 インビトロ成熟実験の日に、成熟培地を準備し（セクション3を参照）。 無菌条件下で50 mLコニカルチューブにL-グルタミン、pH7.0でライボビッツL-15培地20mlを加えます。 10 N NaOHでpHを9.0にそれをもたらします。 2本の別々の50 mLコニカルチューブにライボビッツL-15培地、pHは9.0、の9 mLを加え。ラベル1チューブ「+ DHP」と他の「-DHP。」 + DHP管中、17α、20βジヒドロキシ-4-プレグネン-3-オン（DHP）のdH 2 Oの490μL、及び10％のウシ血清アルブミン（BSA）の500μLの10μLを加えます。 -DHPチューブに、10 MG / mlのゲンタマイシン、400の100μLを加えます81;のdH 2 O、及び10％BSAの500μLのL。 3.卵母細胞の解剖及びインビトロ培養の開始注：in vitroでの培養実験は、それらが自然交配を通じて卵を解放8-10日後に事前に選択されたメスを用いて行われます。同じ日に作られた成熟培地を使用してください（セクション2を参照）。解剖はおそらく自然交配を介して生じるプロセスを模倣し、（魚施設に予め設定人工照明により実験室で測定）魚概日周期13の終わり近くに開始された場合に、卵母細胞を適切に成熟します。これは、魚は標準の光周期の施設に収容されている場合は、プロトコルの中で最もステップは夕方に行わなければならないことを意味する（ 例えば、午前8時から10午後明期と施設で午後6時でステップ3.2から始まります）、他の作業時間期間は適切タイムシフト光周期で可能です。 1 Mトリス、pHは9.0でpH 7.0に緩衝のdH 2 O中の0.2％トリカインストック溶液を調製し、そして4℃で溶液を維持します。これは、事前に準備することができます。 施設で毎日の光サイクルの終了前に、実験0~4時間を開始します。 250mLのビーカー中で、魚の水の80 mLに、0.2％トリカインストック溶液、pH7.0での20 mLを加え、混合します。 トリカイン溶液に事前に選択されたメスを転送し、露出オーバーでそれらを安楽死させます。鰓運動の停止後15分間トリカイン溶液中の女性を残します。 スプーンを使用して、トリカイン溶液から安楽死させた魚を収集し、魚の水で簡単にそれらをすすぎます。余分な水分を吸収するためにペーパータオルの上に魚を置きます。 胸びれのレベルで安楽死させた魚を刎ねるためにきれいなカミソリの刃を使用してください。解剖ハサミを使用して、肛門部の前端から延びる、魚の腹側に縦切開を行います。 <li>入射光を解剖顕微鏡下でペトリ皿に魚を置き。切開鉗子のペアを使用して、4mLのリーボビッツのL-15培地+ DHPを含有する35×10 mm培養皿に卵巣部分を転送します。 注：発展途上卵母細胞を含んで卵巣は、内部体腔内に不透明と塊状の構造として表示されます。 解剖鉗子を使用して、そっと濾胞大衆から卵母細胞を解離します。ソート早期IV卵母細胞（ 図2B;ほぼ最大サイズで、GV破壊の前に、暗い、不透明細胞質および卵母細胞内の非対称配置は容易に明らかGVによって特徴付けられます）。初期段階（ 図2A）での卵母細胞と（前DHPの治療に図2Cのものと類似しているが卵巣に存在する）半透明の、成熟ステージVの卵を廃棄します。 注：卵母細胞は、早期IV、成熟した、ステージVのoocytになり早い段階で成熟のために選択されていますインビトロ培養条件（ 図2C及びD）後にES 3。 IV期の卵母細胞が活発に製品を生産しているので、この段階での操作は、RNAの注入を介して、または導入のMOを介して遺伝子機能の低減のための外因性産物の発現を可能にします。 4mLのリーボビッツのL-15培地+ DHPを含む第二の35×10ミリメートルのプラスチック培養皿に早期IV卵母細胞を転送するためにガラスパスツールピペットを使用します。 + DHP溶液を含む皿に-DHP媒体の最小量を転送します。 4.卵母細胞のマイクロインジェクション注： 体外成熟に受けて分離され、ステージIVの卵母細胞は、機能的な操作やタグ付けされたタンパク質の発現のための試薬を導入するマイクロインジェクションしすることができます。そのようなmRNAおよびMOS（セクション4を参照）のような試薬のマイクロインジェクションは、典型的には、卵母細胞は、インビトロ matu受けているときに行われます。defolliculation前に+ DHP媒体で配給、。所望であれば、前の卵母細胞の成熟に操作を行うために多くの時間を可能にするために、注射は、少なくとも2時間、熟成の前、-DHP媒体中で行うことができます。彼らは、その後+ DHP媒体に転送することができます。 標準的な発現キットを使用してmRNAを準備します。 50-500 PG /μLの最終濃度で注入するための100〜500頁/μLのストックとして-80℃でそれらを保つRNAグレードの水（200 PG /μL推奨します）。製造元の指示に従って、水に4 ng /μLでの濃度でMOを準備します。 2 NG /μL（又は経験的に決定）の最終濃度でそれらを注入します。 注：注射は一般的に（セクション5でノートを参照してください）defolliculation前に+ DHP媒体中で実施されます。 mRNAを注入する場合、注入の直前に、0.1 MのKClの最終溶液を達成するために、RNAグレードの逆浸透水及び0.2 MのKClを用いてmRNAを希釈します。 MOを注入する場合、注入の直前に、0.1 MのKClの最終溶液を達成するために、逆浸透水、および0.2 MのKClを使用して所望の濃度にMOを希釈します。 手動で微鉗子で卵母細胞を保持し、プルガラスキャピラリーピペットを用いて作られた針を用いて、野生型ステージIVの卵母細胞に約1株NL注入します。 以前にゼブラフィッシュ初期胚15に標準注入のためのプロトコルに記載されているように、加熱されたガラス毛細管を引っ張る注入される溶液をロードし、そして鉗子で針先端を破壊することによって、ガラス針を準備します。 注：針ではなく、急激なものよりも緩やかなテーパを持っている場合、それは便利です。これは、針の先端にある休憩の場所の面でより多くの柔軟性を可能にし、また注入された胚の損傷を防ぐことができます。胚の注射と同じ針および溶液を使用して、事前決定することによって、注入量を調整します所望の容積を作り出すマイクロインジェクター圧力設定。以前に15を説明したように、これらの設定は、モック注入顕微鏡ステージ較正スライド（0.01 mm）の上にミネラルオイルの滴にし、注入された溶液のボーラスで所望の直径を得るために、マイクロインジェクターの設定を調整することによって決定することができます。 5.卵母細胞の成熟とDefolliculation 注：卵成熟の間に、卵母細胞は、成功した培養条件の評価を可能にする、徐々に半透明になります。 未熟をインキュベートし続け（及び、適切な場合、注射）（図2Cを参照）卵母細胞を無傷のままと徐々に半透明になることによって、適切な成熟を受けていることを確認するために定期的に（30分毎に）検査、26.5℃、+ DHP媒体に卵母細胞を。 パスツールピペットで任意の溶解卵母細胞を取り出し、それらを捨てますラボ廃棄物のビーカーにメディアの品質を維持するために。卵母細胞溶解の量に応じて、透明な溶液を維持するために、新鮮な+ DHP媒体の約半分の容量で培地を交換します。 卵母細胞の大部分が半透明になり、もはや明らかであるGV有する（DHPの治療において、約2時間、Dと比較して、 図2Cを参照）までin vitroで成熟が進行することを可能にします。透過光光学系と解剖顕微鏡下でそれらを表示します。 各成熟した卵母細胞から最も外側の濾胞性膜を除去します。卵母細胞と膜の間に増加したスペースを持つ地域の濾胞性の膜で涙を作るために極細のピンセットを使用してください。膜の一部を剥離し、剥離部を押したままの膜から卵母細胞をロール。 注：基礎となる絨毛膜は、一般的に、このプロセスの間に卵と密接に関連して残ります。卵の行為の後ivation、それは胚のための保護層を形成するために拡張されます。 培養（+ DHP）中の数滴を有するペトリ皿に（典型的には、20未満μLで約5~10成熟卵母細胞を転送する）媒体の最小体積で濾胞除去卵母細胞を転送し、受精に進みます。 インビトロ培養卵母細胞の受精6 注：氷上の精子溶液を、以下の準備は、約2時間のためにその効力を維持します。 先に図16、 図17のように、ハンクス溶液の500μLで5人の男性から精巣を用いdefolliculationする卵母細胞の成熟段階の前の終わり近く精子溶液を調製します。 + DHP培養培地中の濾胞除去卵母細胞に精子溶液を10〜50μLを追加します。 10秒待ってください。 ピペットを用いて、卵母細胞を胚（E3）中の数滴を追加します。 PL 1分待ってから、洪水E3培地で食べました。 注：5 mMの塩化ナトリウム、0.17ミリモルのKCl、0.33 mMのCaCl 2を、0.33 mMのMgSO 4を、および1~5％メチレンブルー13を次のようにE3培地の組成物です。 繰り返しは、受精胚のより多くを得るために、5.3、6.2、および6.3を繰り返します。 受精胚を開発できます。以前に受精17及び18をステージングするために記載されているように、成功した受精を確実にするために、切断段階を介して進行を観察するために、透過光光学系と解剖顕微鏡を使用します。