Ontwikkeling van een Economische DNA Delivery System door "Acufection" en de toepassing ervan op Skin Research
Summary
Dit protocol is een kosteneffectief alternatief voor expressie van naakt plasmide DNA in muizenhuid. Het algemene doel van het protocol is immuun-gerelateerde genen in huidweefsel aan de functionele rol van een specifiek gen in huidontsteking bakenen.
Abstract
Ontregeling van de immuunrespons in de huid wordt in verband gebracht met tal van menselijke huid aandoeningen. Rechtstreekse overdracht van immuun-gerelateerde genen in huidweefsel is een fascinerende benadering van immuunmodulatie van cutane ontsteking in muismodellen van ziekten bij de mens te onderzoeken. Hier presenteren we een kosteneffectieve protocol dat naakt DNA in muizenhuid geleverd en leidt tot transgenexpressie. De werkwijze is bedacht "acufection", duidt acu-lek gemedieerde DNA-trans fection. Acufection te voeren, werd muizenhuid eerst toegediend met DNA in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en daarna licht geprikt met een bundel acupunctuurnaalden om de absorptie van DNA en transfectie in cellen te vergemakkelijken. Het plasmide DNA wordt vermoedelijk door de keratinocyten en dendritische cellen (DC's) in de huid genomen en expressie gebracht eiwit. Mechanische prik met de naalden op zich niet leiden tot beschadiging van de huid of induceren keratinocyten activering. De uitdrukkingvan de getransfecteerde genen gedetecteerd in de huid zowel transcriptionele en translationele niveaus na acufection gedurende 2 dagen en onderhouden tot 7 dagen. De primaire doelstelling van de ontwikkeling van deze acufection methode was een niet eerder gedefinieerd isovorm van IL-15 te onderzoeken. Met deze werkwijze wordt een alternatief gesplitste IL-15 isovorm met gedeeltelijk verwijderde exon 7 (IL-15ΔE7) werd tot expressie gebracht in de huid en vervolgens behandeld met een Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), ontsteking veroorzaken. -Acufection geleverd IL-15ΔE7 huid onderdrukte proliferatie van keratinocyten, epidermale dikte en rekrutering van neutrofielen in IMQ geïnduceerde huidontsteking. Met de toenemende belangstelling voor het identificeren van de regulerende mechanismen van huidontsteking, het protocol beschreven verschaft een kosteneffectieve en veelzijdig alternatief voor gen kanonsysteem of microzaaien voor DNA afgifte in vivo. Het kan mogelijk maken ontdekking van de functie van een nieuwgen in de huid of voor het onderzoeken van nieuwe behandeling van huidziekten.
Introduction
Skin is de eerste verdedigingslinie van het lichaam. Keratinocyten (KCS) zijn het belangrijkste celtype in de huid van mensen en muizen. In reactie op prikkels uit de omgeving (bijvoorbeeld zonlicht, zuurstof, chemicaliën en pathogene invasie) worden KCS geactiveerd en produceren een breed scala van pro-inflammatoire cytokines en chemokines zoals IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α en GM-CSF 1. Samen leiden zij de rekrutering van immuuncellen op de huid. Verergerd huidontsteking wordt vaak geassocieerd met talrijke menselijke ziekten, waaronder acute ectopische contact dermatitis en chronische T-cel gemedieerde inflammatie (zoals allergische contact dermatitis en psoriasis) 2. Modulerend pro-inflammatoire reacties in de huid door remming KC activering aannemelijk benadering voor de behandeling van huidontsteking. Dit protocol beschrijft een nieuwe benadering van een cytokine gen in de epidermis transiënte expressie te brengen om immune res bestuderenPonse voortvloeiend uit dergelijke behandeling in de huid.
De epidermis componeert de meest oppervlakkige laag van de huid. Het dient als een fysieke barrière houden externe stoffen zoals nucleïnezuren en pathogenen die in de diepere lagen van de huid. Verschillende naaldvrije technieken zijn vastgesteld voor epidermale DNA-overdracht 3, 4. DNA in oplossing of in verband met kationische liposomen of adenovirusvectoren is rechtstreeks op de epidermis gemodificeerd met technieken zoals het verwijderen van het stratum corneum of de behandeling met reagens ontharen. Verwijdering van de verhoornde epitheel vergemakkelijkt DNA die de epidermale barrière en interactie met keratinocyten en Langerhans cellen immuunresponsen 5 induceren. Terwijl een groot oppervlak is beschikbaar voor DNA-overdracht en deze aanpak niet naalden te betrekken, zijn er nadelen, waaronder de eisde grote hoeveelheden DNA (10-100 ug), harde behandeling van de huid door strippen en inconsistente resultaten in het induceren van immunologische respons in de geïmmuniseerde dieren zonder DNA afgifte booster 6. Micropartikels gemedieerde intracellulaire afgifte van naakt DNA aan de huid is getoond zeer efficiënt en reproduceerbaar is voor het induceren immuunreactie 7, 8 zijn. Een draagbare genpistool werd gebruikt om de huid doelwitplaats met plasmide-DNA beklede gouddeeltjes 2 urn diameter in grootte door middel van stromend helium luchtstroom 9 bombarderen. Het plasmide DNA wordt vermoedelijk door KCsand dendritische cellen (DC's) die in de huid en het eiwit tot expressie lokaal of transport naar drainerende lymfeknopen door DCs 10. Hoewel het gen pistool systeem is eenvoudig en vereist beperkte technische ervaring, de kosten voor de voorbereiding en het leveren van de "DNA bullet "(dat wil zeggen goud poeders, helium gas) en het genenpistool zelf is van algemene toepassing beperkt. Bovendien is de eis van een heliumgas afgiftesysteem beperkt de gemakkelijke gengeweer transport wanneer de proeven op verschillende plaatsen worden uitgevoerd. microzaaien aangetoond is dat een hogere efficiëntie van genoverdracht dan enkele injectie en deeltjesbombardement 11 bereiken. microzaaien gebruikt een tatoegeringskanon om DNA te leveren aan de huid zonder het gebruik van deeltjes kralen 11. Oscillerende de micronaalden op de huid met behulp van deze benadering waarschijnlijk direct schrapen het celmembraan en daardoor overdragen DNA om meerdere cellen tegelijk. echter, pijn bij het grote aantal injecties met 0,254 mm diameter naalden nadeel.
Hier geven we een alternatieve benadering van DNA-afgifte in vivo. De "acufection" </strong> protocol we hier beschreven, verschaft een economische en efficiënte manier om plasmide DNA te leveren in de huid van muizen. In het kort, tien acupunctuurnaalden (0,2 mm diameter x 13 mm lang) werden gebonden in een bundel met plakband. Een volume van 10 pi PBS met 10 pg plasmide DNA dat het transgen van interesse werd op het geschoren, ontharingsmiddelen crème behandelde flank huid. Via de acupunctuurnaald bundel over het oppervlak (1 cm x 1 cm) van de huid oscilleren, werden de keratine in de hoornlaag losgemaakt en het plasmide-DNA op het oppervlak werd geabsorbeerd in de epidermis. Beschadiging van de huid werd gecontroleerd en bleek minimaal te zijn. Expressie van het getransfecteerde gen in de acufected huid werd bevestigd door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en ELISA. Het immuunsysteem modulerende effecten van acufection geleverde IL-15ΔE7 op huidontsteking werden aangetoond met behulp van de IMQ behandelde muismodel 12. Terwijl acufection blijkt te zijn een gemakkelijke en minder dema zijnnding werkwijze voor DNA afgifte in vivo, de optimale hoeveelheid DNA voor verschillende genen en de tijd op de huid prikken moeten zorgvuldig worden geoptimaliseerd om reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stap om de expressie van het plasmide-DNA acufected waarborgen is gelijkmatig oscilleren en draai de hoornlaag van de huid. Terwijl zachtjes duwen de naald zonder dat de huid, moet de kracht hard genoeg om het oppervlak te drukken. Absorptie van DNA in 10 ui oplossing op een 1 cm x 1 cm oppervlak te vergemakkelijken moet de naalden oscilleren op en neer ongeveer 100 keer 30 seconden. Men kan de kracht die moet de huid prikken bepalen en door vaststellend het aantal keren dat nodig is om de beste expre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidie van het ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Wij danken Drs. Betty Wu-Hsieh en Chien-Kuo Lee bij NTU, Leigh Zerboni aan de Stanford University en Dr. Peter Hoffmann aan de Universiteit van Hawaii voor het lezen van het manuscript, Yun Chien bij NTU voor technische bijstand, en Dr Wen-Chi Wei op landbouw biotechnologie Research Center bij Academia Sinica voor technisch advies.
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
References
- Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
- Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
- Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
- Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
- Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
- Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
- Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
- Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
- Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
- Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
- Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
- van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
- Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
- Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5′ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
- Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
- Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
- Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
- Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes’ response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).
