ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督
Summary
ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT のステージ固有操作を使用します。
Abstract
再生医療の主な目的の 1 つは、生成、造血幹細胞 (造血) ひと多能性幹細胞 (hPSCs) 由来のメンテナンスです。最近まで、造血に hPSCs を区別するための努力は主に HSC 可能性を欠いて、代わりに卵黄嚢造血のような造血前駆細胞を生成しています。これらの結果の造血前駆細胞は、様々 な成人造血器疾患、リンパ系統の特にそれらの in vitro疾患モデル作製のためのユーティリティ限られている可能性があります。しかし、最近ここの概要ステージ固有分化プロトコルを使用して hPSCs からエリスロ骨髄リンパ多能決定的な造血前駆細胞を生成する方法を説明しました。基底膜マトリックス コーティング容器に hPSCs の酵素分解による胚様体 (EBs) が形成されています。EBs は、中胚葉に GSK3β 阻害剤の CHIR99021 でその後決定的な造血プログラムに指定されている組換え BMP4 によって区別されます。また、原始造血は PORCN 阻害剤の IWP2 によって指定されます。造血はさらに VEGF 組換え添加および支持造血サイトカインを介して駆動されます。このメソッドを使用して生成された結果の造血前駆細胞疾患と発達モデル、体外に使用される可能性があります。
Introduction
ひと多能性幹細胞 (hPSCs) ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) を包含として定義され、適切な成長条件下で自己更新を受けていない唯一のユニークな能力を持っています。また、あらゆる細胞に分化する能力が 3 つの胚葉から派生: 外胚葉、中胚葉、内胚葉の1。これらのユニークな能力のためは、hPSCs は、再生医療、疾患モデル作製、細胞ベースの治療2に偉大な約束を保持します。種類の細胞は、hPSCs から正常に分化されている、1 つの重要な課題は大人っぽい hPSC 由来造血幹細胞 (造血)、決定的な造血前駆細胞の in vitro仕様。
HPSCs から人間の HSCs の発展に 1 つの可能性があります障壁ヒト胚3で複数の造血プログラムの存在であります。現れる、「原始的な造血、」と呼ばれる最初のプログラムは胚の卵黄嚢の組織内で起きると巨核球、マクロファージ、赤芽球前駆細胞 (EryP フロン) の一時的な生産が最大の特徴です。特に、このプログラムは、造血に上昇を与えないもそれは T および B リンパ球前駆細胞に上昇を与えるが。ただし、卵黄嚢では、エリスロ骨髄前駆 (EMP4,5,6,7,8) など、制限された決定的な造血前駆細胞に上昇を与えるは一過性赤血球欠乏リンパ プライミング多能性前駆 (LMPP9)。ただし、EMPs でも LMPPs でもない、完全に多能性または成人レシピエントにおける HSC のような生着が可能です。対照的に、開発で後で古典的な定義の「決定的な」造血プログラムは、HSC を含むすべての成人造血系統に上昇を与える、適切な胚大動脈性腺発生地域で指定されます。これら胎児内決定的な造血細胞の仕様は、hemogenic (彼) 内皮3,10,11 から内皮-造血移行を介しての Notch 依存的ファッション ,12,13,14。溶解能力は別として潜在的な multilineage とこれらの細胞の依存性のノッチを EMP と (文献参照3,13 LMPP からこれらの決定的な造血前駆細胞を区別するために使用できます。).
HPSCs からプリミティブと決定的な造血仕様を支配する機構を理解することは可能性が高いさまざまな hPSC ラインの決定的な造血前駆細胞の再現性のある生産に不可欠。最近まで、プリミティブと決定的なの多能性造血前駆細胞を分離できれば hPSC 微分のプロトコルには、15,16,17,18がありませんでした。 19,20,21,22,23,24,25。最初に牛胎児血清 (FBS) および/または間質共培養を使用多くのアプローチ説明プリミティブと決定的な造血潜在的な15,16、混合 hPSC 分化の造血の可能性 17,19,22,23,25。さらに、造血無血清の多くのプロトコルは、港湾の造血潜在的な18,20,21, hPSCs から中胚葉の仕様は信号の要件を説明しています。24します。 ただし、これらのメソッドはまだ両方のプログラムの異種混合物に上昇を与えた、と臨床応用と理解の発達メカニズムの使用は限定される場合があります。
我々 は最近概説アクチビン/節点と hPSC から派生した中胚葉18,26 からプリミティブと決定的な造血仕様における WNT シグナルのステージ固有の信号要件を持つこれらの研究で構築して.ステージ固有 WNT 信号操作の使用は、専らプリミティブまたは決定的な造血前駆細胞26排他的のいずれかの仕様に、後者は特にユニークです。中胚葉仕様、中に PORCN 阻害剤 IWP2 とカノニカル WNT シグナル伝達の阻害の結果 CD43 の仕様で+ EryP フロン ・骨髄前駆細胞、リンパ球検出可能性のないです。対照的に、カノニカル WNT シグナル GSK3β 阻害剤、CHIR99021 と分化の段階で同じ刺激検出 CD43 の完全な不在で起因した+ EryP フロン、同時にリードしながらに、CD34 の仕様+CD43−彼。この人口が骨髄性、所有していたHBG-赤芽球と T リンパ球の可能性を表現します。以降の解析には、CD7327,28 ・ CD18428、その造血可能性の表現としてはノッチ依存28だったこれが識別されます。さらに、単一細胞のクローン性解析は、これらの決定的な造血系統の多能性の単一細胞28が由来することを示した。一緒に取られて、これらの研究は、純粋な原始造血前駆細胞や多能性 NOTCH 依存的決定的な造血前駆細胞、ステージ固有 WNT 操作ができますを示します。
ここでは、我々 は WNT シグナリング中胚葉のパターン形成とその下流の造血系統の試金の操作を介して排他的プリミティブまたは決定的な造血系細胞を生成する我々 の差別化戦略を概説します。このプロトコルは、再生医療用 hPSCs からプリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の生産に興味を持っている研究者に大きな価値です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、プリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の分化の急速、血清無料、実質無料のメソッドについて説明します。プリミティブ型または決定的な造血前駆細胞の中胚葉性仕様は、一意にカノニカル WNT シグナルの小分子阻害剤を悪用当社のプロトコルを使用して確実に実現できます。CHIR9902133 GSK3β 阻害剤によるステージ固有 wnt シグナルの活性化を生?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、血液部門内科学、ワシントン州大学医科大学院によってサポートされています。CD は、国民の中心、肺および血の協会からの T32HL007088 によって支えられました。CMS は、血液学者賞のアメリカの社会によって支えられました。
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
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