Hazırlama ve Değerlendirilmesi<sup> 99m</sup> Bioorthogonal Kimya Kullanarak Öncesi hedeflemek için üç dişli Şelatlar Tc-etiketli
Summary
Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.
Abstract
Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.
Introduction
99m Tc dünya çapında yılda 1, 2, 3 başına yapılan 50 milyon görüntüleme işlemleri ile teşhis nükleer tıpta kullanılan baskın radyoizotop kalır. Klinik olarak kullanılan 99m Tc ajanların çoğunluğu perfüzyon tipi radyofarmosötik. 99mTc, bir hedef yapıya ligasyon aracılığıyla belirli bir biyomarker bağlamak için yönlendirildiği aktif hedef bileşiklerin sınırlı vardır. Hedeflenen 99m Tc radyofarmasötik oluşturulması genellikle ilgi biyobelirteci bağlamak için hedef molekülün yeteneği 99m Tc-ligand komplekslerinin etkisiyle tarafından engellendiği ya da izotoplar yarı ömrü daha yüksek molekül ağırlıklı biyomoleküllerin kullanım için yeterince uzun değildir antikorlar gibi. görüntüleri Tiss olmayan hedefinden temizlemek biyomolekülün için sırayla edinilen önce ikincisi genellikle birkaç gün gerektirir ues. Ön hedefleme bu zorlukların üstesinden gelmek için alternatif bir yaklaşım sunuyor.
Bioorthogonal kimya ile birlikte ön hedefleme hem floresan ve radyo-görüntüleme 4, 5, 6, 7, 8 yeni moleküler görüntüleme probları geliştirmek için etkili bir yol olduğu görülmüştür. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, 1,2,4,5-tetrazin (Tz) ve trans -cyclooctene (TCO) türevleri arasında ters elektron talebi Diels-Alder (IEDDA) Reaksiyon, 6, özellikle etkili olduğu gösterilmiştir. Bu bileşenleri ile IEDDA reaksiyonu ve yüksek seçicilik, in vivo ön hedefleme uygulamalar 9, 10 için idealdir (2 ≈ 6,000 M -1 s -1 k) PBS içinde hızlı kinetik sergileyebilirler.
e_content "> en sık kullanılan yaklaşım TCO türetilen hedefleme vektör uygulanması ve yeterli bir gecikme süresinden sonraki kapsar, bir radyo-etiketli tetrazin uygulanır. Radyoaktif tetrazinler olmuştur 11 ° C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr ve 111 In dayalı , 13, 12, 11, 14, 15 bildirilmiştir. Buna karşın, in vivo olarak proteine bozulmasını önlemek için ko-ligand kullanımını gerektiren HYNIC tipi ligand kullanılarak hazırlanmıştır Tz Tc-99m etiketli, tek yayın vardır 16. bir alternatif olarak, + çekirdek [3 99mTc (CO)], bir kararlı üç dişli kompleksleri oluşturan bağların bir ailesi kullanılarak tetrazinler etiketli burada 99mTc (I) 'in sentezi açıklanmıştır. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pyaş = "1">
Şekil 1: tetrazin ve trans -cyclooctene arasındaki bioorthogonal IEDDA reaksiyonu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hazırlanan ligandlar ailesi polarite ve metal bağlanma bölgesi ve Tz (Şekil 2) arasında bağlayıcı grubun doğasına değişir üç dişli şelatları içerir. Amaç, yüksek hedef-to-hedef dışı oranları elde etmek amacıyla, Tc-tetrazin etkin bir şekilde lokalize ve TCO-etiketli in vivo siteleri ve bağlı değilken hızla net ile reaksiyona olabilir inşa eden 99m belirlemektir. Ligandları test etmek için, bir bisfosfonat bir TCO-türevi (TCO-BP) 17 kullanılmıştır. Bu TCO-BP aktif kemik metabolizmasının bölgelerine lokalize ile reaksiyona girerek daha önce göstermiştirin vivo 18 radyo-etiketli tetrazinler. Bu tek bir aşamada hazırlanabilir ve deneyler lokalizasyon esas olarak eklem (diz ve omuz) meydana gelir, normal farelerde gerçekleştirilebilir, çünkü yeni bir tetrazinler test etmek için uygun bir reaktiftir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Farklı kutuplar tetrazin-bağlı üç dişli şelatların koleksiyonu hazırlandı ve in vivo olarak bir TCO türevi ile IEDDA reaksiyonunda kendi 99mTc komplekslerinin yardımcı değerlendirildi. Etkili ve tekrarlanabilir 99mTc etiketleme yöntemi ligand konsantrasyonu etiketleme adım (Bileşikler 2-5), t-butil gruplarının korumasının kaldırılması izledi 10 -3 M, beş tetrazin-çelatları için geliştirilmiştir. Ligandın konsantrasyonu yü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.
Materials
| Argon gas | Alphagaz | — | — |
| Na2CO3 | EMD Millipore | 106395 | — |
| Na2B4O7.10H2O | Anachemia | S9640 | — |
| KNaC4H4O6.4H2O | Anachemia | 217255 | — |
| Technelite 99mTc generator | Lantheus medical imaging | — | Source of 99mTcO4- |
| 0.9% Saline | Lantheus medical imaging | — | To elute generator |
| 1 M HCl | Lab Chem | — | — |
| MeOH | Caledon | — | — |
| ACN | Caledon | — | HPLC grade |
| Millipore H2O | Thermo Fisher Scientific | Barnstead Nanopure | — |
| DCM | Caledon | — | — |
| TFA | Caledon | — | — |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 1X |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | — |
| Tween80 | Sigma Aldrich | P8047 | — |
| Isoflurane | CDMV | 108737 | Supplier: Fresenius Kabi Animal Health |
| HPLC | Waters | 1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590) | — |
| HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 | Phenomenex | 00G-4435-E0 | Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm, |
| HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 | Waters | 186003115 | XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm |
| Microwave Reactor | Biotage | Initiator 8 | — |
| Biotage V10 Evaporator | Biotage | Serial # V1041 | — |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25R | — |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | — |
| Animal room scale | Mettler Toledo | XP105 Delta Range | — |
| Microwave vials | Biotage | 355629 | 0.5-2 mL |
References
- Jurisson, S. S., Lydon, J. D. Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals. Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).
- Kluba, C. A., Mindt, T. L. Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals. Molecules. 18, 3206-3226 (2013).
- Amato, I. Nuclear Medicines Conundrum. Chem. Eng. News. 87 (36), 58-70 (2009).
- Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications. J. Nucl. Med. 28 (8), 1294-1302 (1987).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity. J. Am. Chem. Soc. 130 (41), 13518-13519 (2008).
- Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging. Bioconjugate Chem. 19 (12), 2297-2299 (2008).
- Rossin, R., et al. In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angew. Chem., Int. Ed. 49 (19), 3375-3378 (2010).
- Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Mol. Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
- Rossin, R., et al. Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems. Bioconjugate Chem. 24 (7), 1210-1217 (2013).
- Rossin, R., Robillard, M. S. Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice. Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).
- Denk, C., et al. Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging. Angew. Chem., Int. Ed. 53 (36), 9655-9659 (2014).
- Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation. Chem. Commun. 49 (36), 3805-3807 (2013).
- Li, Z., et al. Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes. Chem. Commun. 46 (42), 8043 (2010).
- Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. 68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers. Chem. Commun. 50 (40), 5215-5217 (2014).
- Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. J. Nucl. Med. 54 (8), 1389-1396 (2013).
- García, M. F., et al. 99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging. Bioorg. Med. Chem. 24 (6), 1209-1215 (2016).
- Russell, R. G. G. Bisphosphonates: The First 40 Years. Bone. 49 (1), 2-19 (2011).
- Yazdani, A., et al. A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines. J. Med. Chem. , (2016).
- Alberto, R., et al. A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand. J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).
- Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3. J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).
- Lu, G., et al. Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).
- Maresca, K. P., et al. Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics. Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).
- Bartholomä, M. D., et al. Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes. ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).
