Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

1. Enfekte Elma Ağaçlarının gelen Kök ve yaprak örnekleri Toplama Not: Patojen spesifik DNA kök ya da yapraklardaki saflaştırılabilir. Aşağıdaki bölüm hem örnekleme için bir protokol sağlar. DNA hazırlığı için köklerinden numune toplama ve hazırlama "Elma çoğalması" e özgü belirtiler 30, 31 ve semptom-ücretsiz kontrol ağaçları ile enfekte ağaçları belirleyin. 1 cm ve yaklaşık 5 sm bir uzunluğa – temiz budama makası kullanılarak, 0.5 bir çapa sahip kök örnekleri kesti. ve kök sisteminin üç farklı, uzak sitelerden kesilmiş numuneler, yeterince etiketli plastik torbalar içine koydu. soğutulmuş termal paketleri ile soğuk kutu içinde örnekleri tutmak ve daha fazla işlem kadar 4 ° C'de buzdolabında saklayın. Not: Kök mimarisi ve yapısı fizyolojik durum o göre değişebilirAğacın f. Üç farklı sitelerde örnek ve çok ince rootlets almak önemlidir. örnekler 4 ° C 'de pek çok gün süre saklanabilir, fakat, daha uzun depolama süresi kalıp riskini arttırır. Küflenmiş örnekleri DNA hazırlanması için kullanılamaz. toprağı temizlemek için su ile kök örnekleri durulayın. steril bir petri koyun ve kök epidermis ve korteks kaldırmak için steril bir neşter kullanabilirsiniz. % 70 (v / v) etanol su çözeltisi daldırma, silme temiz, tüy bırakmayan bir doku ile neşter temizleyin ve bir açık alev (örneğin, Bunsen beki) ters ısı sterilize edin. steril bir 2.0 ml reaksiyon tüpüne doğranmış floem 100 mg – 30, neşter ile floemi Scratch küçük parçalar halinde doğrayın ve kısım. Birkaç ay boyunca -80 ° C 'de numuneler saklayın. Numune toplama ve yapraklardan hazırlanması Bir virüslü ve asemptomatik kontrol ağacı tespits aşama 1.1.1.1 açıklanan ve ağaç başına on yarasız yaprakları seçin. durum başına bir ağaç yeterlidir. Su ile yaprakları durulayın ve% 70 (h / h) etanol çözeltisi püskürtülerek yüzeyleri temizlemek. steril bir petri yaprakları koyun ve steril bir bisturi ile her yaprağın orta damarı (santral ven) teşrih. , Yaprak orta damarı epidermisi ve korteks kaldırmak küçük parçalar halinde kesilmiş yaprak orta damarı ve steril bir 2.0 ml reaksiyon tüpüne yaprak orta damarı doku kısım 100 mg. Birkaç ay boyunca -80 ° C 'de, DNA hazırlama veya deposu için hemen örnekleri kullanın. 100 mg bölümler halinde bitki materyali kana uygun ve eninde sonunda depolama için onları dondurmak için: edin. Her eş pay, doğrudan DNA hazırlamak için de kullanılabilir. Donmuş bitki materyali parçaları oluşturmak eğilimindedir beri derin dondurulmuş bitki materyali Tartı, hantal. 2. setiltrimetilamonyum bromit (CTAB) DNA hazırlama tabanlı <p class = "jove_content"> Not: DNA, bitki malzemesi için herhangi bir sütun-bazlı DNA saflaştırma yöntemi kullanılarak saflaştırılabilir. Bu bölümde, DNA arıtma için bir CTAB-bazlı yöntem tarif edilmektedir. DNA saflaştırma başka yerde 32 tarif değiştirilmiş protokole dayalı olarak yapılır. Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: CTAB tamponu: (: 364,45 g / mol CTAB, E r), 100 mM trishidroksimetilaminomethan (Tris, E r: 121.14 gr / ml), 1.4 M sodyum klorür (NaCI, E r: 58.44 g V setiltrimetilamonyum bromid% 1 w / çözündürün / mol), ve 20 mM etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu (NaEDTA, E r: 372,24 g / mol), su ve bunların pH 8.0'a ayarlayın. N-loroilsarkosin tamponu: ve 100 mM Tris, ve su içinde 20 mM NaEDTA 8.0 pH ayarlamak N-loroilsarkosin sodyum tuzu 33 (293,38 g / Mol M R) a / h% 10 içinde çözündürülür. Tris-EDTA (TE) tampon maddesi: Su ve autocl 10 mM Tris ve 1 mM NaEDTA çözülürçözüm ave. Amonyum asetat solüsyonu: su içinde solüsyonu ve 120 ° C'de otoklav ve 20 dakika boyunca 1.2 bar: 5 M amonyum asetat (77,0825 g / mol M R) hazırlayın. CTAB tamponu, 300 uL, N-loroilsarkosin tamponu 30 uL, proteinaz K 6 uL (10 ug / ml) ve 12 uL taze veya dondurulmuş doğranmış bitki malzemesinin (aşama 1.1.2.2.), 100 mg – 30 karıştırın 2-merkaptoetanol 34 (M R: 78,13 g / mol). 60 ° C'de 60 dakika boyunca çalkalayın. mix geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. amonyum asetat çözeltisi 360 uL ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. Çözelti 5 dakika için oturup, ve daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüj olarak bildirin. Temiz bir şişeye süpernatantı aktarın ve buz gibi soğuk izopropanol 35 720 mcL ekleyin. -20 ° C'de en az 30 dakika boyunca DNA hızlandırabilir. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüj karışımıC ° ve supernatant atın. buz soğukluğundaki% 70 etanol, 500 uL pelet yıkanır ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15,000 x g'de aşağı döndürün. Etanol Süpernatantı atın ve hemen kalıntı damlacıkları çıkarmak için temiz bir kağıt havlu üzerine flakon batırın. Mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarmak için emin olun. 15-20 dakika boyunca veya bir vakum yoğunlaştırıcı santrifüj içinde 2-3 dakika için pelet hava-kurutun. Aşırı ısıtma veya genişletilmiş buharlaşma kez pelet aşırı kurutmayın. TE tamponu, 700 uL pelletini ve sonunda çözülmesini kolaylaştırmak için 37 ° C'ye ısıtın. RNAse 10 uL (10 ug / ml) ilave edilir ve 300 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de 15 dakika için inkübe edilir. Izoamil alkol 36: 24: 1 ve iyice karıştırın kloroform 700 uL ekleyin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüjleyin karışımı ve yeni, temiz bir şişeye yüzer üst faz transfer. ekleyerek üstte yüzen madde içindeki DNA çökeleği(: 60.1 g / mol izopropanol, E r) ve -20 ° C'de en az 30 dakika süreyle inkübe edilmesi, 2-propanol 35 ve 700 uL. 4 ° C'de 30 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin karışımı ve supernatant atın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 x g'de 70% etanol ve santrifüj 500 uL pelet yıkayın. Adım 2.5 açıklandığı gibi pelet kurutun. TE 50 uL içinde eritin. PCR ile 3. Tespit Candidatus fitoplazmalar mali-spesifik DNA Nükleaz içermeyen su içinde bitki maddesinden 1:10 saflaştınldı DNA seyreltilir ve patojen-spesifik primerler 37 ile bir PCR çalıştırın. S. Mali phytoplasma 37 için primer ve spesifik problarla kantitatif PCR protokol kullanılarak bitki malzemesinin P. Mali özgü DNA'nın varlığını tespit etmek. Ca, ilgili prob ile aynı PCR gerçekleştirilerek diğer 16SrX phytoplasma üyeleri olmadığını kontrolnd. P. prunorum ve cand için. P. pyri DNA 37. NOT: enfekte olmayan ağaç DNA Bu kontrol bir patojene olmadığını teyit etmek için de test edilmelidir. Bu adımda, P. Mali dışında bir phytoplasma türden efektör amplifiye riskini arttıracaktır yana diğer yakından ilgili phytoplasma türe ait DNA, numunede mevcut olması önemlidir. Başka yakından ilişkili P. mali 16SrX grup phytoplasma ile karışık enfeksiyon ilgili problar ile örnek analiz ederek dışladı. beklenen sonuçlar, diğer 16SrX phytoplasma için negatif olmalıdır beri, PCR etkinliğini göstermek doğru pozitif kontrolleri dahil etmek önemlidir. 4. Potansiyel Efektör Gene Genişletici ve Y2H Bait vektör içine alt klonlama Primerler 5 kullanan Mali P. phytoplasmal gen atp_00189 (sinyal peptit parçası içermeyen) yükseltmek-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (ileri) ve 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (geri), sırasıyla 5 've 3' uçları, EcoRI ve SalI kısıtlama bölgeleri ile genişletilmiştir. Bir sütun tabanlı DNA saflaştırma yöntemi ile PCR ürünü saflaştırılır. EcoRI ve Sall ligasyonu yoluyla Y2H yem vektörü pLexA-N içine amplikon Clone. Not: Burada, EcoRI ve SalI 100 ng pLexA-N vektörü Benzer PCR amplikonu, 1 U T4 ligaz atp_00189 sindirilmiş 15 ng ile birleştirildi linearize. Ligasyon (25 ° C'de pH 7.9) 40 mM Tris-HCl içeren tampon içinde gerçekleştirildi, 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol (DTT, E r: 154,25 g / mol) ve 0.5 mM adenozin trifosfat (ATP, E R: 16 ° C, gece boyunca (14-20 saat) 10.0 uL toplam hacim içinde 507,18 g / mol). Malus x domestica bağlanarak spesifik primer ekarte etmek için aynı primerler ile enfekte olmamış ağacından DNA analiz </Em> DNA. E.coli elektro hücrelerine ligasyon karışımı 1 uL Dönüşümü ve Luria-Bertani kanamisine dirençli klonlar seçmek (LB) plakaları 50 ug / ml kanamisin sülfat 38 ile takviye edilmiştir. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir sütun-bazlı plazmid mini hazırlık seti ile seçilen bakteri klonlarından geri plazmid DNA saflaştınlır, ve sıralama 39 ile insertin başarılı entegrasyon ve yönünü kontrol edin. Potansiyel Efektör Protein Öz aktivasyonu (Otomatik aktivasyon) için 5. Test Aşağıdaki tamponlar ve büyüme ortamının hazırlanması: NOT: maya-selektif plakalar hyphenates için isimlendirme ile ilgili ortam eksik amino asit kısaltmaları bir "-" kısaltma öncesinde. Örneğin, SD-Trp-Leu-Plakasını tüm amino asitleri, ancak Trp Leu ve onun içerir. 10x Bırakma karışımı: tartılırL-arginin monohidroklorür, 200 mg (E R: 210,66 g / mol), L-izolösin, 300 mg (E R: 131.17 g / mol), L-lisin monohidrat 269 mg (E R: 164.21 g / mol), L-metionin, 200 mg (E R: 149,21 g / mol), L-fenilalanin (500 mg E R: 165,19 g / mol), L-treonin 2 g (E R: 119,12 g / mol), 300 mg L-tirosin (MR: 181,19 g / mol), L-urasil (112,09 g / mol) ve 200 mg, ve L-valin 1.5 g (E R: 117,15 g / mol). iki kez damıtılmış su, 1 L bunları çözülür ve çözelti otoklav. 4 ° C'da, çözelti tutun. NOT: İlgili bırakma karışımı da satın premix olabilir. 10x L-adenin ek L-adenin hemisülfat tuzu (ADE, E r: 184,17 g / mol), 100 mg ağırlığında ve iki kez damıtılmış suyun 50 mL içinde çözülür. Filtre 0.22 mikron gözenek filtre ile çözüm sterilize edin. 10x L-histidin ek: L-histidin monohidroklorür monohidrat 100 mg tartılır (onun, M r </sub>: iki kez damıtılmış su ve filtre 50 ml 209,63 g / mol), 0.22 mikron gözenek filtresi ile sterilize edin. 10x L-lösin ilave: iki kez damıtılmış su, 50 mL ve filtre 0.22 mikron gözenek filtresi ile sterilize: L-leucine (113.17 g / mol leu, E r), 500 mg tartılır. 10x L-triptofan Ek: iki kez damıtılmış su, 50 mL ve filtre 0.22 mikron gözenek filtresi ile sterilize: L-triptofan (204,23 g / Mol, trp, E r), 100 mg ağırlığında. SD-Trp-Leu-His-ADE orta ve levhalar (amino asitler olmadan) v maya azot baz w /% 0.67 çözülür ve% 2 ağırlık / hacim, D-glükoz monohidrat: çiftli (M R 198,17 g / Mol) su ve otoklav damıtıldı. agar plakaları için,% 2 w / otoklavlama öncesi hacim agar (mikrobiyolojik kalite) ekleyin. Seçici plakaları hazırlamak otoklava Sd-Trp-Leu-His-ade ortama amino asit stok çözeltisi 1x ekleyin. levhalar hazırlanırken, ağar eklemeden önce ~ 50 ° C'ye kadar soğutuldu olduğundan emin olunamino asitler. Steril stok çözümleri tutun. İpad ortamı (: 184,17 g / mol M R) ve / h glukoz monohidrat% 2 w 1 v maya hülasası w /%% 2 w / v pepton (mikrobiyolojik derecesi), ağırlık 0.004 / hac% adenin hemisülfat tuzu çözülür su ve otoklav iki kez damıtılmış. İpad agar plakaları, V agar w / otoklavdan önce% 2 ekleyin. 2x İpad hazırlanması için, yukarıda sözü edilen maddelerin iki katı konsantrasyonlarda kullanmak. Not: nedeniyle orta yüksek glukoz konsantrasyonuna (İsteğe bağlı), 2x İpad orta otoklav sonrası koyu kahverengimsi olur. Bir seçenek olarak, bir% 40 (a / h) glukoz stok çözeltisi hazırlanmış ve 0.22 um'lik bir filtreden geçirilerek sterilize edilebilir. Filtre ve sterilize edilen glukoz stok çözeltisi daha sonra steril şartlar altında otoklava 2x İpad (eksik glukoz) ilave edilir. hacim hatalarını önlemek için, 2x İpad 10x glikoz çözeltisi daha sonra ilave edilir akılda tutarak, hazırlıklı olmalıdır. Bu demektir ki, örneğin, yerine 1 L u nedenlef ortamı, sadece 900 ml (glikoz dışındaki tüm bileşenleri içeren) hazırlanmış ve otoklavlanmış ve glukoz, stok çözeltisi 100 ml ilave edilir. Test kendi kendine aktivasyonu için lityum asetat dolayımlı dönüşüm maya Streak Saccharomyces cerevisiae muhabir suşu NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2: :( LexAOp) 4-HIS3 ura3: :( LexAOp) 8-lacZ ade2: :( LexAOp) 8-ADE2 GAL4) a dan bir İpad agar plakası üzerinde dondurulmuş gliserol stok ve 30 ° C sıcaklıkta 48 saat için inkübe edilir. Bu plaka koloniler ve İpad ortamı 50 mL inoküle. Maya büyür ve büyümesini izlemek için düzenli olarak OD 600 ölçmek edelim. Maya son OD 0.5-0.8 600 büyümek edelim. 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj bunların hücreleri pelet ve iki kez damıtılmış, otoklava 2.5 mL su bunları tekrar süspansiyon. maya süspansiyonu 100 uL altı alikotları hazırlayın ve 50 240 mcLAğ / hac% polietilen glikol 4000 (PEG, E r: 3,500-4,000 g / mol), 1 M lityum asetat dihidrat 36 uL (LiOAc, E r: 102,02 g / mol) ve ağırlık / hacim% 2 25 uL salmon sperm DNA'sı (çözünmüş). iki kez damıtılmış, steril su ile tüm reaktifler hazırlayın. Aşağıdaki plazmid vektörü DNA, "a" "F" maya süspansiyonu içeren altı şişe etiketleme ekleyin: negatif kontrol: (a) 1,5 efektör (pLexA-N-atp00189 28) ile bir yem plazmid ug, (b) boş av plazmid 1.5 ug pGAD HA 41, (c), boş bir yem vektörünün 1.5 ug pLexA-K 41, ve (d) 1.5 boş yem vektörü pLexA-N ug boş av plazmid pGAD-HA 1.5 ug; Pozitif kontroller: (e) Pozitif kontrol yem plazmid DNA pLexA-p53 41 ve pozitif av plazmid Paktı-larget 41 1.5 ug 1.5 ug; ve öz-aktivasyon testi: (f) ba 1.5 ugo efektör (pLexA-N-atp00189) ve boş av plazmid pGAD-HA 1.5 ug plazmid. kuvvetli tepkiler karıştırın ve bir su banyosu içinde 42 ° C 'de 45 dakika süre ile inkübe. 700 x g'de 5 dakika boyunca hücreler pelet ve süpernatant atılır. Aşağıdaki seçici plakaları üzerine 50 uL yayıldı (48.44 g / mol NaCI, E r):% 0.9, 250 uL (ağırlık / hacim) sodyum klorür çözeltisi içinde hücrelerin tekrar SD-Trp, Sd-Leu, SD-trp Leu, SD-Trp-Leu-His, ve SD-Trp-Leu-His-ade. 30 ° C'de 4 gün – 3 inkübe edin. inkübasyonun ilk günün ardından, kurumasını plakaları önlemek için plastik parafin film ile plakaları mühür. plakalar üzerinde maya büyüme kontrol edin. 6. Test efektör ifade Efektör zaman N-terminalinde birleştirilir Lex A etikete karşı bir antikor ile Western blot 42 efektör ekspresyonunu testpLexA-N olarak ifade edilmiştir. Not: translasyonel erimiş Lex-A etiket ilgilenilen proteinin gerçek ağırlığı yaklaşık 24 kDa ekler düşünün. Western Blot protein büyüklüğünü belirlerken bu önemlidir. 7. Y2H Ekran Streak pLexA-atp00189 (efektör) taze SD-trp plaka üzerinde NMY51 -transformed ve 2 büyümesine izin – kırmızı koloniler görünene kadar, 30 ° C'de 3 gün. agar plakasından kırmızı koloni ile küçük çalkalama şişesi içinde SD-Trp ortamının 3 mL inoküle 120 çalkalayarak 30 ° C'de gece boyunca inkübe – 150 rpm. Bir gecelik kültürün 1 mL bir çalkalama şişesi içinde SD-Trp 'nin 20 mL inoküle ve 8 saat süre ile büyümesine izin. SD-Trp ortamı eklenerek 600 = 0.2 OD ve başlatıcı kültürü, her 10 mL şişeler çalkalanarak 2x 100 mL aşılamak için kültür ayarlayın. 30 ° C de çalkalanarak bir gece boyunca büyütün. Not: maya 6 OD büyümek değil emin olun00> 0.5 ve taze SD-trp ile seyreltin. OD 600 ve pelet 120 OD 600 ölçün "birimleri." 600 1.2 OD ölçülmüştür, örneğin, 100 ml aşağı spin supernatant atmak ve bir manyetik karıştırma çubuğu ile bir çalkalama şişesi içinde önceden ısıtılmış 2x İpad 800 mL pelletini. , 2 ml kısım aşağı Spin süpernatant kaldırmak ve su pelletini. Maya süspansiyonunun OD 600, 0.15 ile 0.2 arasında olduğundan emin olun. Değilse, 2x İpad ile ayarlamak veya gece kültürden daha mayayı ekleyin. Not: 2x İpad koyu kahverengi ve OD ölçümü sonuçlarını etkileyebilir. Nedenle, OD belirlemeden önce su içinde maya hücrelerini yeniden askıya almak için gereklidir. orta koyu renklendirme önler aşama 5.1.8 notta tarif edildiği gibi bir seçenek olarak, 2x İpad ayrı glikoz sterilize edilerek hazırlanabilir. Bir uygulamada kalan maya kültür inküberopriately (2 L'lik bir çalkalama şişesinde 800 ml ya da iki 1 L sallama şişeleri içine 2 x 400 mL bölmek) çalkalama şişesi boyutlu ve 30 ° C, 120 ° inkübe – 150 rpm. 0.6 600 ulaşıldığında bir OD (- 6 saat 4 sürer) kadar her 1.5 saat yaklaşık OD 600 ölçün. Bu arada, bir sonraki aşamada tarif edilen çözüm hazırlanması. Lityum asetat dolayımlı dönüşüm su içinde hac somon sperm DNA /% 2 w çözülür ve 100 ° C 'de bir su banyosunda 5 dakika boyunca 500 ul kaynatın. 2 dakika süreyle buz tüpü yerleştirin ve ısıtma adımı tekrarlayın. sonraki kullanıma kadar buz üzerinde DNA tutun. Aşağıdaki karışımları hazırlayın: TE / LiOAC karışımı: ve steril, iki kez damıtılmış su 21.84 mL 1 M LiOAC 3.08 mL, 100 mM Tris 3.08 mL / 10 mM EDTA (7.5 pH) karıştırın. PEG / LiOAc karışımı: ve PEG 4000 (w / v) 50% 33.6 mL 1 M LiOAc 4.2 mL, mM Tris 4.2 mL / 10 mM EDTA (7.5 pH) birleştirin. Santrifüj 800 ml maya kültürü (OD 600 = 0.6)700 x g'de 5 dakika pelet hücreleri için. Süpernatantı ve steril, iki kez damıtılmış 200 ml su içinde tekrar süspansiyon pelet. 5 dakika boyunca 700 xg'de tekrar pelet hücreleri ve supernatant atın. Not: santrifüj için çeşitli şişe içine gerekli bölmek ise süspansiyon. 7.7.3 sıvı hacimleri. ve 7.7.4. 800 mL 'lik süspansiyon elde bütün pelet bakın. TE / LiOAc karışımı 16 mL pelletini (adım 7.7.1.1 bakınız); 5 dakika boyunca 700 xg'de aşağı spin ve süpernatant atın. TE / LiOAC karışımı 9.6 mL pelletini. pGAD-HA-cDNA kütüphanesi vektör 7 ug 12 şişeler,% 2 somon sperm DNA (adım 7.7), 100 uL, ve PEG / LiOAc karışımı 2.5 ml: aşağıdaki reaksiyon uygun şekilde boyutlandırılmış Reaksiyon polipropilen damarlarının karışımları hazırlayın. 12 viallerin her adım 7.10 maya hücre süspansiyonu 600 ul ilave edin ve 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın. Bir su banyosu içinde 30 ° C'de 45 dakika boyunca reaksiyon karışımı inkübeşiddetle her 15 dakikada karıştırın d. Her flakon DMSO 160 mcL ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 42 ° C'de 20 dakika daha karışım inkübe edin. 5 dakika boyunca 700 xg'de hücreleri topak süpernatantı atmak ve 2x İpad 3 mL her pelletini. Havuzu tüm 100 ml'lik bir çalkalama şişesinde (12 şişeleri 36 mL toplam) hücreleri ile 30 ° C de 90 dakika ve 120 devir için maya inkübe edin. 700 x g'de 5 dakika boyunca hücreler pelet ve süpernatant atılır. NaCI (ağırlık / hacim) steril% 0.9 4.5 mL pelet yeniden süspanse edin ve 10 ml serolojik pipet yardımıyla dikkatli bir şekilde pipetli ve aşağı iyice karıştırın. 50 uL çekiniz ve on kat 1 kadar 1:10 ila% 0.9 NaCl içinde dilüsyonları hazırlamak: 1,000. SD-Trp-Leu agar içeren 90 mm Petri tabaklarda her seyreltme plaka 100 uL. SD-trp-leu-onun-ade agar ile 16- x 150 mm çaplı petri üzerinde seyreltilmemiş maya tabanda kalan yayıldı. Kendi kendine aktivasyonunu azaltmak için ortama 3-AT ekleyin. SD-Trp-Leu inkübe30 ° C'de dört gün boyunca üç gün plakalar ve SD-Trp-Leu-His-ade plakalar. NOT: seçici plakalar üzerinde görünen klonlar (potansiyel) etkileşim çiftleri ve yem etkileşim ortağı pGAD-HA plazmid kodlama taşırlar. SD-Trp-Leu seçme plakaları üzerinde farklı seri dilüsyonları kolonileri sayılarak transfeksiyon etkinliğini belirler. çekme ve taze SD-Trp-Leu-His-ADE seçici plakalar üzerine Steril bir pipet ucu ile koloni çizgiler, her bir klon aktarın. 30 ° C'de 24 saat süreyle inkübe edin. Beş pasajların toplam ulaşana kadar her gün bu adımı yineleyin. Seçici Tabaklar Klonların 8. Analiz Steril örtünün altındaki her klon için SD-Trp-Leu-His-ade 1 mL bir steril 2-ml tepkime tüpü hazırlayın. sıcak bir iğne ile her bir tüp içine bir delik ve gaz geçirgen mühürleyen bir parça ile deliğe kapsamaktadır. Taze koloni arkadaşı ile her flakon aşılamak 150 rpm'de çalkalanarak, 30 ° C'de 24 saat boyunca inkübe, bir klon (5. geçtikten sonra klonlar kullanımı adım 7.17) için arteryel. Not: 4 ° C'de birkaç gün muhafaza plakalardan alınan maya, sıvı bir ortam içinde 24 saat içinde yeterli büyümez, çünkü yeni bir plaka klonları almak önemlidir. 4.000 x g'de 5 dakika boyunca maya pelet ve süpernatant atılır. (Ilgili plazmid DNA miniprep kiti) uygun tabanda tampon içinde pelletini ve taze bir 2.0 mL reaksiyon tüpüne aktarın. asitle yıkanmış cam boncuklar (425- 600 um çapında), 100 uL ilave edilir ve 5 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın. İlgili lizis tamponu ekleyin ve üreticinin talimatlarına göre bir plazmid hazırlama, mini kiti kullanılarak plazmid saflaştırma ile devam edin. su 50 uL plazmid DNA yıkayın. av plazmid özgü primer GAL4ADseq bir sıralama reaksiyonunun Aşama 8.3 DNA kullanarakref "> 41 5'ACCACTACAATGGATGATG -3 '. Tarafından etkileşimi doğrulayın de novo eş-dönüşüm 43, 44 yem ve av vektör. SD-Trp-Leu-His-ade seçme plakaları üzerinde dönüştürülmüş maya seçin.