De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Sanger de sequenciação tem sido, tradicionalmente, o padrão de ouro em ambos os testes para mutações somáticas conhecidos e desconhecidos. Uma das limitações de Sanger de sequenciação é o seu limite de detecção (~ 10 – 20% alelo mutante em um fundo de WT) ^1. Este nível de sensibilidade é inadequado para a detecção de mutações somáticas de baixo nível, que podem estar presentes em amostras a partir de tecidos pré-malignas ou doentes com algumas células tumorais em circulação, ou quando a medula óssea (BM) é irregular. Isto também faz com que a avaliação de doença residual após terapia ou detecção de mutações resistentes emergentes durante a terapia difícil por sequenciação convencional sozinho ^2. Através da substituição de PCR convencional com ácido nucleico bloqueado (LNA) mediada de tipo selvagem bloqueio de PCR (WTB-PCR), na sequenciação de Sanger, sensibilidades de até 0,1% alelo mutante em um fundo de WT pode ser obtida ^{2, 3, 4.} DentroWTB-PCR, o enriquecimento para os alelos mutantes é conseguido através da adição de uma pequena (~ 10-14 NT) de bloqueio (LNA) oligonucleótido que se liga preferencialmente ao ADN WT impedindo assim a amplificação de ADN WT. O produto WTB-PCR enriquecido mutante pode em seguida ser sequenciados. Ao bloquear ADN WT em vez de seleccionar para mutações específicas WTB-PCR permite o enriquecimento de ambas as mutações conhecidas e desconhecidas presentes em fracções celulares hora.

Vários métodos são actualmente utilizados para a detecção de mutações em fracções de células pequenas. Isto inclui por PCR, do sistema específico de alelo amplificação refractário mutação (ARMS), desnaturante cromatografia líquida de alta eficiência (DHPLC), grânulos, emulsões, amplificação, e magnetos (radiante), libertação induzida por um campo eléctrico e de medição (Efirm), de alta resolução ponto de fusão e outros. No entanto, a maioria desses métodos são limitados por falsos positivos e a capacidade de detectar apenas uma mutação que o ensaio foi concebido para ^quatro </sup>. WTB-PCR, no entanto, permite ao utilizador visualizar os traços de sequenciação que permite a detecção de vários tipos de mutação e podem auxiliar na exclusão de falsos positivos devido a artefactos ou eventos de desaminação. sequenciação próxima geração (NGS) pode oferecer uma alternativa adequada para a sequenciação convencional, no entanto, substancialmente maiores custos, complexidade e tempo de ensaio mais o tornar uma opção desnecessária para muitos tipos de doenças com alguns marcadores moleculares distintos ou para a monitorização de pacientes em terapia para emergente mutações de resistência. Além disso, as altas taxas de falsos positivos, quando detectam variantes com frequências de alelos mutantes de menos de 5% pode representar um problema para NGS à base de amplicon ^{5, 6.}

Aqui demonstramos o aumento da sensibilidade obtida por WTB-PCR em rastreio de mutações no gene de diferenciação mielóide factor de 88, tal como descrito por Albitar et al. Mutatio ³ MyD88ns são factores de diagnóstico e prognóstico importantes em Macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), IgM monoclonal gamopatia de significado desconhecido (IgM-MGUS), linfoma da zona marginal esplénica (SMZL), e linfoma difuso de grandes células B (DLBCL). MyD88 mutações são encontrados em quase todos os casos de WM e aproximadamente 50% dos pacientes com Imunoglobulina M (IgM) secretores MGUS. Em contraste, as mutações MyD88 são encontrados em apenas 0-6% dos doentes com SMZL e estão ausentes no mieloma múltiplo ^{7, 8.} Porque morfológica sobreposição, imunofenotípicas, citogenética, e características clínicas entre WM e SMZL ou mieloma múltiplo IgM muitas vezes pode complicar o diagnóstico diferencial, a presença de uma mutação MyD88 pode servir como um factor de identificação útil ^9. MyD88 mutações também têm sido associadas com uma maior carga da doença em pacientes com DLBCL e sobrevivência global pobre seguintes terapia ^7, </sup> ^10. Além disso, porque as mutações MyD88 são mais frequentemente encontrados na célula B semelhante (ABC) DLBCL activada do que o centro germinal B-célula-like (GCB) DLBCL ou linfoma de células B do mediastino primário (PMBL), estado de mutação MyD88 pode servir como um marcador substituto para o subtipo de ABC ^{11, 12.}

O protocolo detalhado fornecida aqui serve como um molde a partir do qual novos ensaios podem ser desenvolvidos ou a maioria dos ensaios de sequenciação existentes podem ser facilmente adaptadas para detectar com precisão as mutações de baixa frequência em vários tipos de amostras. A abordagem também pode ser utilizada para monitorar e detectar mutações resistentes que podem desenvolver-se tumores ou mesmo bactérias que podem desenvolver enquanto os pacientes estão a ser tratados com terapia direcionada ou antibióticos. Além disso, aborda e remédios muitos dos problemas associados com o enriquecimento de mutação, especialmente no tecido embebido em parafina fixado em formalina (FFPE).