Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations

Le séquençage Sanger a toujours été l'étalon-or dans les tests pour les mutations somatiques connues et inconnues. L' une des limitations de séquençage de Sanger est sa limite de détection (~ 10 – allèle mutant de 20% dans un fond de WT) ^1. Ce niveau de sensibilité est inapproprié pour la détection de mutations somatiques de bas niveau qui peuvent être présents dans des échantillons de tissus de patients prémalignes ou avec peu de cellules tumorales circulantes, ou lorsque la moelle osseuse (BM) est inégale. Cela rend également l' évaluation de la maladie résiduelle après le traitement ou la détection des mutations de résistance émergents au cours du traitement par séquençage conventionnel seul difficile ^2. En remplaçant la PCR classique avec un acide nucléique verrouillé (LNA) médiée par PCR de blocage de type sauvage (WTB-PCR) dans le séquençage de Sanger, les sensibilités allant jusqu'à 0,1% allèle mutant dans un fond de WT peuvent être obtenus ^{2, 3, 4.} DansWTB-PCR, l'enrichissement pour les alleles mutants est réalisée par l'addition d'un court (~ 10 – 14 NT) de blocage (LNA) oligonucléotide qui se lie préférentiellement à l'ADN WT empêchant ainsi l'amplification de l'ADN WT. Le mutant enrichi produit WTB-PCR peut être séquencée. En bloquant l'ADN WT plutôt que de sélectionner des mutations spécifiques WTB-PCR permet l'enrichissement des deux mutations connues et inconnues présentes dans les fractions cellulaires minute.

Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées pour détecter des mutations dans les petites fractions de cellules. Ceci inclut le système de mutation allèle-spécifique PCR, réfractaire amplification (ARMS), la dénaturation Chromatographie en phase liquide à haute performance (DHPLC), des billes, des émulsions, l'amplification et le magnétisme (ensouplage), la libération du champ induit électrique et de mesure (EFIRM), haute résolution point de fusion et d'autres. Cependant, la plupart de ces méthodes sont limitées par des faux positifs et la capacité de détecter une seule mutation que le test a été conçu pour ⁴ </sup>. WTB-PCR, cependant, permet à l'utilisateur de visualiser les traces de séquençage qui permet la détection de plusieurs types de mutation et peuvent aider à écarter les faux positifs dus à des artefacts ou des événements de désamination. séquençage de nouvelle génération (NGS) peut offrir une alternative appropriée au séquençage classique, cependant, essentiellement des coûts plus élevés, la complexité et plus le temps d'essai rendent une option inutile pour de nombreux types de maladies avec quelques marqueurs moléculaires distincts ou pour le suivi des patients sous traitement pour les nouveaux mutations de résistance. De plus, les taux élevés de faux positifs lors de la détection des variants avec des fréquences d'allèle mutant de moins de 5% peuvent poser un problème pour NGS à base ^{amplicons-5, 6.}

Ici , nous démontrons l'augmentation de la sensibilité obtenue par WTB-PCR dans le dépistage des mutations dans le facteur de différenciation myéloïde 88 gène tel que décrit par Albitar et al. ³ MYD88 mutations sont importants facteurs diagnostiques et pronostiques dans la macroglobulinémie de Waldenström (WM), gammapathie monoclonal IgM de signification inconnue (IgM-MGUS), le lymphome splénique de la zone marginale (SMZL) et lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL). mutations MyD88 se trouvent dans presque tous les cas de WM et environ 50% des patients avec des immunoglobulines M (IgM) sécrétant GMSI. Par contraste, les mutations MyD88 se trouvent dans seulement 0-6% des patients atteints de SMZL et sont absents dans le myélome multiple ^{7, 8.} Parce morphologiques qui se chevauchent, immunophénotypique, cytogénétique, et les caractéristiques cliniques entre WM et SMZL ou multiple IgM de myélome peuvent souvent compliquer le diagnostic différentiel, la présence d'une mutation MyD88 peut servir de facteur d' identification utile ^9. Mutations MyD88 ont également été associés à une plus grande charge de morbidité chez les patients atteints DLBCL et une mauvaise survie globale après un traitement ^7, </sup> ^10. De plus, parce que les mutations MyD88 sont plus fréquemment trouvés dans activé cellules B comme (ABC) DLBCL que centre germinatif B-alvéolaire (GCB) DLBCL ou de lymphome à cellules B médiastinale primaire (PMBL), le statut de mutation MYD88 peut servir marqueur de substitution pour le sous – type ABC ^{11, 12.}

Le protocole détaillé fourni ici sert de modèle à partir duquel de nouveaux tests peuvent être mis au point ou la plupart des tests de séquençage existants peuvent être facilement adaptés pour détecter avec précision les mutations à basse fréquence dans différents types d'échantillons. L'approche peut également être utilisé pour la surveillance et la détection de mutations résistantes qui peuvent se développer dans les tumeurs ou même les bactéries qui peuvent se développer alors que les patients sont traités avec la thérapie ciblée ou des antibiotiques. En outre, il traite et des remèdes beaucoup des problèmes liés à l'enrichissement de mutation, en particulier dans les paraffine fixés au formol (FFPE) tissus.