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신경과학

Laden eines Kalziumfarbstoffs in Froschnervenendungen durch den Nervenstumpf: Calciumübergangsregistrierung im Frosch Neuromuscular Junction

Published: July 08, 2017
doi:
10.3791/55122
, , , ,
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Scientific Centre, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics,Russian Academy of Sciences, 2Open Laboratory of Neuropharmacology,Kazan Federal University, 3Department of Radiophotonics and Microwave Technologies,A.N. Tupolev Kazan National Research Technical University, 4Department of Medical and Biological Physics,Kazan State Medical University

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs durch den Froschnervstumpf in die Nervenendigungen. Wir stellen auch ein Protokoll für die Aufzeichnung und Analyse von schnellen Calcium-Transienten in den peripheren Nervenenden vor.

Abstract

Eine der am meisten machbaren Methoden zur Messung von präsynaptischen Calciumspiegeln in präsynaptischen Nervenendigungen ist die optische Aufzeichnung. Es basiert auf der Verwendung von calciumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen, die ihre Emissionsintensität oder Wellenlänge in Abhängigkeit von der Konzentration an freiem Calcium in der Zelle verändern. Es gibt mehrere Methoden, um Zellen mit Kalziumfarbstoffen zu färben. Am häufigsten sind die Prozesse der Beladung der Farbstoffe durch eine Mikropipette oder Vorinkubation mit den Acetoxymethylesterformen der Farbstoffe. Allerdings sind diese Methoden nicht anwendbar auf neuromuskuläre Übergänge (NMJs) aufgrund methodischer Probleme, die entstehen. In diesem Artikel stellen wir eine Methode zum Laden eines kalziumempfindlichen Farbstoffs durch den Froschnervstumpf des Froschnervs in die Nervenendigungen vor. Da der Eintritt von externem Calcium in Nervenendigungen und die anschließende Bindung an den Calciumfarbstoff innerhalb der Millisekunden-Zeitskala erfolgt, ist es notwendig, ein schnelles Bildgebungssystem zu verwenden, um diese interactio aufzuzeichnenNs Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Aufzeichnung des Calcium-Transienten mit einer schnellen CCD-Kamera.

Introduction

Calciumionen (Ca 2+ ) beteiligen sich an vielen neuronalen Signalisierungsprozessen, einschließlich der Initiierung, Instandhaltung und Plastizität der Mediatorfreisetzung 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Bei der Ankunft des Aktionspotentials tritt extrazelluläres Ca 2+ in das Nervenendgerät ein und initiiert die Neurotransmitterfreisetzung. Bei einigen Synapsen kann der Calciumstrom direkt durch elektrophysiologische Methoden 6 , 7 , 8 gemessen werden. Im Falle des neuromuskulären Übergangs (NMJ) kann man aufgrund der geringen Größe der Nervenendigungen keine direkte Patch-Clamp- und Zwei-Elektroden-Spannungsklemme verwenden.

Aufzeichnungen von nach innen gerichteten Ca 2+ Strömen aus den Nervenendigungen im NMJ können durch indirekte Elektrophys durchgeführt werdenIologische Methoden 9 , 10 . Diese Verfahren erfordern jedoch die Vorbehandlung der Synapse durch Natrium- und Kaliumionen-Kanalblocker. Optische Verfahren erfordern keine pharmakologische Trennung von Ionenströmen im Nervenendgerät und erlauben Aufnahmen von Ca 2+ -Einstrom, die durch Aktionspotentiale ausgelöst werden, und die anschließende Erhöhung von Ca 2+ -Ionen im Axoplasma 11 , 12 , 13 , 14 . Diese Methoden basieren auf Aufzeichnungen von Veränderungen der Fluoreszenz von spezifischen Ca 2+ -sensitiven Farbstoffen bei der Bindung von freien Ca 2+ -Ionen 15 , 16 , 17 , 18 , 19 .

Ca 2+ Indikatoren können in die c geladen werdenElls durch eine Vielzahl von Methoden, je nach dem Zweck des Experiments. Forscher nutzen die Badanwendung von membranpermeablen Farbstoffformen 20 , 21 , Beladen über Patchpipette 22 oder Mikroinjektion 23 , 24 , 25 . Allerdings haben alle diese Methoden einige Einschränkungen im Falle des NMJ aufgrund seiner Besonderheiten in der synaptischen Architektonik. Für die NMJ ist die bequemste und erfolgreichste Methode, den Farbstoff durch den Nervenstumpf zu laden, ein Vorwärtsfüllverfahren 26 , 27 , 28 , 29 . Diese Technik kann zum Laden verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe in die peripheren Nervenendigungen verwendet werden. Diese Methode wurde erfolgreich für Drosophila Nerven-Terminals 28 , die Eidechse Motor Nerv verwendet28 und Froschmotornervenanschlüsse 17 , 26 , 27 , 30 . Je nach Untersuchungsobjekt können methodische Details variieren. Eine Glas-Mikropipette kann für kleine Nerven von Larven 28 eingesetzt werden . Mehrere Forscher haben eine Methode 27 , 28 beschrieben , in der ein frisch geschnittenes Ende des Nervs, das einen Muskel innerviert, in eine mit einem Farbstoff vorgefüllte Vertiefung eingetaucht wird. Die Vorbereitung wird dann für mehrere Stunden belassen, um den Farbstoff einzuweichen. Der Farbstoff wird von den Axonen eingeweicht und zu den Nervenendigungen transportiert. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zum Beladen eines Fluoreszenzindikators in Frostmotornervenendigungen durch den Nervenstumpf. Unser Protokoll verwendet eine Plastikpipettenspitze für die Inkubation des Gewebes mit einem Farbstoff. Wir beschreiben auch, wie man Ca 2+ Fluoreszenz tra zu erwerben und zu analysierenNsients

Protocol

Experimente wurden an isolierten Nervenmuskelpräparaten des Musculus-Hautpectoris aus dem Rana-Ridibund- Frosch durchgeführt. Die Größe der Tiere beider Geschlechter betrug etwa 5-9 cm. Die experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien für die Verwendung von Labortieren der Kazan Federal University und der Kazan Medical University in Übereinstimmung mit dem NIH Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Das experimentelle Protokoll erfüllte die Anforderungen der Richtlinie 86/609 / EWG der Europäischen Gemeinschaften und wurde vom Ethischen Komitee der Kazan Medical University genehmigt. 1. Vorbereitung der Lösungen Vorbereitung der Ringer-Lösung. Vorbereitung der Ringer-Lösung: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHCO 3 und 1,8 mM CaCl 2 . Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4 ein. Ringer-Lösung mit einem niedrigen Ca 2+ vorbereiten </Sup> und hoher Mg 2+ -Gehalt: 113,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 3,0 mM NaHCO 3 , 6,0 mM MgCl 2 , 0,9 mM CaCl 2 . Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2-7.4 ein. Vorbereitung der Farbstoff-Beladungslösung Die wasserbasierte Lösung, die HEPES-Na enthält, bei 10 mM (pH 7,2-7,4) vorbereiten. Zugabe von 14 μl der HEPES-Lösung zu einer Durchstechflasche mit dem Farbstoff 30 . HINWEIS: Der Ca 2+ Indikatorfarbstoff kommt in eine 500 μl Durchstechflasche mit 500 μg Pulver. Vortex und Spin unten, um gründlich zu mischen. Verdünnen Sie die Lösung, um die Endkonzentration des Ca 2+ Indikators auf 30 mM zu bringen. Vermeiden Sie Licht und lagern bei -20 ° C. 2. Dye-loading Vorgehensweise Dissect den Haut Pectoris Muskel mit einem Stück der Pectoralis Proprius Nerv. HINWEIS: Das Sektionsverfahren steht zur VerfügungIn einem kostenlosen Download der Zeitung von Blioch et al. , 1968 31 . Für die Dissektion Verfahren, verwenden Sie zwei feine Pinzette und Hornhaut Schere (siehe die Tabelle der Materialien ). Übertragen Sie das seziertes Gewebe in eine mit Ringer-Lösung vorgefüllte, mit Silicium-Elastomer beschichtete Petrischale und fixieren Sie das Gewebe mit feinen Edelstahl-Stiften, so dass es leicht in der Schale gedehnt wird. Die Petrischale mit einem frischen Aliquot der Ringer-Lösung wieder auffüllen. Entfernen Sie das Bindegewebe. Beschädige den Nerv nicht. Die Abfüllpipette vorbereiten: Mit einer Rasierklinge ein 2 mm langes Stück des konischen Teils einer handelsüblichen Plastik 10 μl Pipettenspitze ausschneiden. Bereiten Sie ein Stück Modellier-Ton vor, um die Füllpipette auf der Petrischale zu montieren. Verbinden Sie die Rückseite der Füllpipette mit einer Plastikspritze über Silikonschlauch und Kunststoff-Anschlussadapter aus Pipettenspitzen. Vor dem dSie laden die Ringer-Lösung aus der Petrischale mit einer Plastikpipette. Trocknen Sie die Muskel-Nerv-Vorbereitung mit einer feinen Spritze; Dadurch wird die Verdünnung des Ca 2+ -Farbstoffes bei der nachfolgenden Beladung der Füllpipette verhindert. Entfernen Sie die Ca 2+ Indikator-Durchstechflasche aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur an einem dunklen Ort auftauen. Unter Stereomikroskop-Steuerung mit geringer Vergrößerung (10 ×), erkennen die Verbindung zwischen dem Muskel und dem Nerv. Mit feinen Pinzetten und Scheren, schneide den Pectoralis Proprius Nerv in der Nähe der Muskeloberfläche (siehe Schritt 2.1). Lassen Sie einen Nervenstumpf ca. 2 mm lang. Fixieren Sie die mit dem Schlauch versehene Füllpipette und die Spritze auf der Petrischale mit dem Modellieren von Ton. Bewegen Sie die Spitze der Pipette in die Nähe des Nervenstumpfes. Ohne ihn zu kneifen, den Nervenstumpf sanft in die Spitze der Füllpipette zu strecken. Den Saugschlauch vom Blun entfernenT Ende der Füllpipette. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Lösung aus der Füllpipette mit einer Spritze mit langer Nadel (siehe Tabelle der Materialien ). Kneipen Sie nicht den Nervenstumpf. Die Spitze der Füllpipette leicht vertikal anheben und den Nervenstumpf in die Spitze stecken lassen. Isolieren Sie den angesaugten Teil des Nervenstumpfes von der Außenseite der Füllpipettenspitze mit Petroleumgelee. Den Nervenstumpf, der bei Bedarf in der Füllpipette isoliert ist, abtrocknen: den Überlauf der Lösung aus der Füllpipette vorsichtig mit einer Spritze mit langer Nadel abspülen. Zeichnen Sie 0,5 μl der Farbstoff-Beladungslösung (siehe Schritt 1) ​​mit einer Pipette mit einer langen Pipettenspitze. Die Pipettenspitze vorsichtig in die Füllpipette legen. Die Mischung direkt auf den Nervenstumpf auswerfen. Das offene Ende der Füllpipette mit Vaseline abdichten. Füge ein kleines Aliquot von Ringer's hinzuAuf die Petrischale, um die Zubereitung nass zu halten. Inkubieren Sie die Zubereitung bei Raumtemperatur unter dunklen und nassen Bedingungen für 5 h. Entfernen Sie die Füllpipette mit der Beladungslösung, spülen Sie die Zubereitung mit der Ringer-Lösung aus und bewahren Sie sie über Nacht im Kühlschrank bei 8 ° C auf. 3. Vorbereitung des Gewebes für die Mikroskopie Montieren Sie das Präparat in die Silicium-Elastomer-beschichtete Kammer und fixieren Sie es mit Stahl-Mikronadeln, so dass es leicht gestreckt wird. Spülen Sie das Gewebe mit einem Aliquot der frischen Ringer-Lösung. Verwenden Sie eine Saug-Elektrode, um den Nerv zu stimulieren; Aufbau der Elektrode ist ab dem kostenlosen Download des Papiers von Kazakov et al. , 2015 32 . Positionieren Sie die Elektrodenspitze nahe an das geschnittene Ende des Nervs und saugen Sie den Nervenstumpf in die Elektrodenöffnung ein. Montieren Sie die Vorbereitungskammer auf der Mikroskopstufe. PlacE die Temperatursonde und die Einlass- und Auslassbrände in der Kammer. Verbinden Sie das Netzkabel mit dem Peltier-Element. Um die Vorbereitung zu überbrücken, verwenden Sie ein einfaches Schwerkraft-System. Um die überschüssige Lösung zu entfernen, schalte die Perfusions-Saugpumpe ein. Schalten Sie die Thermo-Controller-Einheit ein. Stellen Sie die Temperaturregelung auf 20 ° C ein. Den Ultraviolettschutzschild montieren. Verbinden Sie die stimulierende Drahtelektrode mit dem elektrischen Stimulator und beobachten Sie die Muskelkontraktionen unter dem Mikroskop mit einem 4fach Objektiv. Füllen Sie das Perfusionssystem mit der Ringer-Lösung mit niedrigem Ca 2+ und hohem Mg 2+ -Gehalt auf. HINWEIS: Diese Lösung wird verwendet, um Muskelkontraktionen zu verhindern. Eine Abnahme der Konzentration von externem Calcium und eine Erhöhung des externen Magnesiums führt zu einer Verringerung der Amplitude von Ca 2+ -Transienten. Auf der Grundlage früherer Erfahrungen wurden jedoch 0,9 mM CaCl <sub> 2 und 6 mM MgCl 2 reichen noch aus, um die Amplitude der Ca 2+ -Transienten zuverlässig aufzulösen. Es ist erwähnenswert, dass es einige andere Möglichkeiten gibt, Muskelkontraktionen zu verringern, ohne die Ca 2+ -Konzentration zu reduzieren. Zum Beispiel würde die Verwendung von d-Tubocurarin oder alpha-Bungarotoxin, spezifische Blocker von nikotinischen Acetylcholinrezeptoren, ganz oder teilweise Muskelzuckungen blockieren 17 , 27 , 28 , 30. Jedoch kann die Zugabe dieser Toxine auch den präsynaptischen Calciumeintrag beeinflussen. Um dies zu vermeiden, kann μ-conotoxin GIIIA verwendet werden 27 . Schalten Sie die Pumpe ein und starten Sie die Superfusion der Präparation mit der Ringer-Lösung mit niedrigem Ca 2+ und hohem Mg 2+ . Wechseln Sie zum 40 × Objektiv auf dem Mikroskop. Schalten t Er Monochromator (siehe Tabelle der Materialien ). Wählen Sie eine Emissionswellenlänge von 488 nm und eine kontinuierliche Beleuchtungsart in der Monochromator-Steuerungssoftware. Bei hoher Vergrößerung im Fluoreszenzmodus ist darauf zu achten, dass die Nervenklemmen mit dem Farbstoff beladen wurden. Abbildung 1 : Nerven und Klemmen mit geladenem Ca 2+ Indikator. ( A ) Nerv gefüllt mit Ca 2+ Indikator nach dem Ladevorgang. Maßstab = 200 μm. ( B ) Nervenendigungen mit Ca 2+ Indikator gefüllt Maßstab = 20 μm. ( C ) Ca 2+ -indikator-Fluoreszenz ist deutlich sichtbar im Nervenende. Maßstab = 20 μm._blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Man läßt die Zubereitung für mindestens 30 min in der Niedrig-Ca 2+ und der Hoch-Mg 2+ -Lösung äquilibrieren. 4. Videoaufnahme mit der Digital CCD Kamera Anmerkung: Die Details der Erfassung von Fluoreszenzsignalen sind für jedes Mikroskop und Kameratyp spezifisch, aber die Hauptbetrachtung ist die Bildaufnahmegeschwindigkeit. Verwenden Sie 1 kHz als minimale Aufnahmefrequenz für Aufnahmen von einzelnen Ca 2+ Transienten im NMJ. HINWEIS: Für die Fluoreszenz-Bildgebung sind schnelle digitale CCD-Kameras erforderlich (siehe Tabelle der Materialien ). Das Datenerfassungssystem und die Software (siehe Tabelle der Materialien ) wurden hier für die Synchronisation von Kamera, Monochromator und Stimulator verwendet. Kurz gesagt, erlaubt dieses Protokoll die Erzeugung von Synchronisationsimpulsen an digitalen Ausgängen der DatenErfassungssystem, um den Verschluss zu öffnen, das Videosignal zu erfassen und Stimulation zu initiieren. Alle zeitlichen Parameter können in den Protokollen und / oder auf den Geräten eingestellt werden. Ein typisches Protokoll ist eine Serie von 500 Bildern, die bei 1 kHz (80 x 80 Pixel) aufgenommen wurden. Die Beleuchtung mit Anregungslicht kann den Ca 2+ Indikator ausbleichen und das Zellgewebe photodamieren. So vermeiden Sie lange Belichtungsrisiken. In diesem Protokoll ist der Shutter nur für die Zeit geöffnet, die benötigt wird, um das Video zu erfassen. Erwerben Sie zwanzig Serien pro spezifischem Nervenendgerät. Ziel ist es, die gleichen Standorte in der Kontrollgruppe und nach der Medikamentenabgabe zu überwachen. Unter dem 4X Objektiv eines Mikroskops verwenden Sie das Hellfeldregime, um die Muskel- und Nervenzweige zu visualisieren. Wechseln Sie auf die 40X Objektivlinse und suchen Sie mit dem Epifluoreszenzregime und einer Anregungswellenlänge von 488 nm nach farbstoffbeladenen Nervenendungen. Identifizieren Sie eine nervenende Region von Interesse. Auf dem trinokulären Rohr oF das Mikroskop, wähle die Lichtweg-Austauschstufen: 100% Licht zur Kamera. Starten Sie die Erfassungssoftware für die CCD-Kamera. Unter "Live" -Modus finden Sie den ROI und passen Sie den Fokus an. Wählen Sie das Menü "Ändern". Verwenden Sie die "Grundkonfiguration" bei 1.000 Bildern pro Sekunde (fps) mit einer Auflösung von 80 x 80. Stellen Sie die Anzahl der Eingabefelder auf 500 ein. Geben Sie den Namen des Experiments ein. Wählen Sie "Externer Trigger". Stellen Sie die Vor-Trigger-Zeit auf 10 ms ein. Legen Sie die Anzahl der Wiederholungen auf 20 fest. Wählen Sie in der Monochromator-Steuerungssoftware eine Emissionswellenlänge von 488 nm und den Modus "externe Triggerbeleuchtung" aus. Führen Sie die Datenerfassungssoftware aus. Laden Sie das Stimulationsprotokoll. Bevor Sie das Video aufnehmen, erfassen Sie den dunklen Rahmen mit der Video-Erfassungssoftware. Führen Sie das Stimulationsprotokoll aus. Wählen Sie den ROI und checK das aufgezeichnete Signal. 5. Datenanalyse NoOTE: Für die Datenanalyse verwenden Sie die CCD-Kamera-Software und ImageJ; Die Daten werden als Kurve in einem Tabellenkalkulationsprogramm dargestellt. In der CCD-Kamera-Software, durchschnittlich 20 Wiederholungen und exportieren Sie die Ergebnisse in eine ImageJ-Support-Datei. Wählen Sie in ImageJ den ROI und den Hintergrund aus. Subtrahiere den Hintergrund vom ROI. Stellen Sie die Daten als Verhältnis dar: (ΔF / F 0 -1) x 100%, wobei ΔF die Intensität der Fluoreszenz während der Stimulation ist und F 0 die Intensität der Fluoreszenz in Ruhe ist. Klicken Sie in der Erfassungssoftware für die CCD-Kamera auf Datei> Durchschnittliche Dateien. Wählen Sie die Dateien aus und bewerten Sie sie. Speichern Sie die gemittelte Datei als .fit-Datei, indem Sie auf "Save as Fit file" klicken. Führen Sie die ImageJ Software aus. Führen Sie die folgenden Schritte aus: Klicken Sie auf Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast. Klicken Sie auf Bild> Stapel> Werkzeuge>; Stapelsortierer Klicken Sie auf Analysis> tools> ROI Manager. Ziehen Sie die gemittelte .fit-Datei in das ImageJ-Fenster. Vergrößere das Fenster für eine bessere Ansicht. Wenn Sie den Cursor bewegen, wählen Sie den letzten Rahmen aus und löschen ihn (dies ist der dunkle Rahmen) Wählen Sie einen rechteckigen ROI über dem Bereich, der als Hintergrund betrachtet wird. Füge es dem ROI-Manager hinzu Messen Sie den Hintergrund, indem Sie auf Mehr> Multi Measure klicken. Beachten Sie die MEAN. Kopiere die Daten, exportiere sie in ein Tabellenkalkulationsprogramm und berechne den Mittelwert der Schwelle für ein Verhältnis. Subtrahiere den Schwellenwert von den Stapeln, indem du auf Prozess> Haupt> Subtrahier klickst. Geben Sie den gemittelten Wert des Schwellenwerts ein. Wählen Sie einen rechteckigen ROI um ein Nerven-Terminal. Füge es dem ROI-Manager hinzu. Messen Sie durch Klicken auf Mehr> Multi Messen. Beachten Sie die MEAN. Kopiere und exportiere sie in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Durchschnitt der Offset der Signale. HINWEIS: Verwenden Sie dieZuerst mehrere Dutzend Punkte, die die Basisfarbstofffluoreszenz ohne Stimulation zeigen; Das ist die Fluoreszenz in Ruhe. Teilen Sie die Signale durch die Fluoreszenz in Ruhe. Subtrahiere "1" und multipliziere mit 100%. Zeichnen Sie das Signal und berechnen Sie die Amplitude des Ca 2+ transienten.

Representative Results

Nach der Farbstoffbeladung und bei der motorischen Nervenstimulation kann in den Nervenendigungen eine Erhöhung der Amplitude des Fluoreszenzsignals (Ca 2+ transient) detektiert werden (siehe Abbildung 2 ). Die Parameter der Ca 2+ -Transienten sind in Tabelle 1 dargestellt . Quantitativ sind die Parameter der Ca 2+ -Transienten, die in unserer Studie gemessen wurden, in der Nähe der Daten, die von anderen Wissenschaftlern bei Synapsen von kaltblütigen Tieren 15 , 34 erhalten wurden . Die Parameter der Ca 2+ -Transienten hängen von der Bindungsrate von Ca 2+ mit dem Farbstoff und der anschließenden Dissoziation ab. Die Eintrittsrate von Ca 2+ in die Nervenendung, die Wechselwirkung mit dem Farbstoff und die Diffusion im Cytoplasma beeinflussen die Anstiegszeit des Ca 2+ transienten. Die Abklingzeit des Fluoreszenzsignals hängt von der Affinität des Farbstoffs ab,Die Geschwindigkeit der Ca 2+ -Interaktion mit intrazellulären Puffern und die Entfernung durch Ionenpumpen 35 . Die Amplitudenanalyse von Ca 2+ -Transienten kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Substanzen auf den Calciumeintrag zu untersuchen, der an der Neurotransmitterfreisetzung 33 beteiligt ist . Abbildung 2 : Die gemittelte Ca 2+ Transient gemessen im Frosch NMJ. Der Ca 2+ -Transient wurde auf der Basis des Durchschnitts der Signale von 13 Frosch-NMJs berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. HauptΔF / F (%) Anstiegszeit 20% -80% (ms) Τ (ms) 12,6 ± 1,1 (n = 13) 4,6 ± 0,5 (n = 13) 115,3 ± 8,3 (n = 13) Tabelle 1: Die gemittelten Parameter des Ca 2+ transienten. Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt; N ist die Anzahl der Messungen in verschiedenen NMJs. Der Peak ΔF / F ist die gemittelte Amplitude von ΔF / F.

Discussion

In dieser Arbeit präsentierten wir die Methode der Durchführung von Ca 2+ -sensitiven Farbstoffbeladung in Froschnervenenden durch den Nervenstumpf. Am Ende des Ladevorgangs haben alle Terminals im proximalen Teil des Nervs signifikante Fluoreszenzwerte. Es wurde geschätzt, dass die intra-terminale Konzentration der Sonde zwischen 40 und 150 μM 17 variiert.

Das Inkubationsverfahren wird in zwei Schritten durchgeführt: bei Raumtemperatur und dann bei einer niedrigeren Temperatur im Kühlschrank. Es ist wichtig, die Zeit der Gewebeinkubation mit dem Farbstoff bei Raumtemperatur zu kontrollieren. Abhängig von der tatsächlichen Länge des Nervenstumpfes, dem spezifischen Farbstoff und der Temperatur kann die Inkubationszeit variieren. Wenn überbelichtet, können Terminals in den proximalen Teilen nahe dem Nervenstumpf überlastet werden. Doch im mittleren Teil des Nervs ist es immer noch möglich, Terminals zu finden, die zufriedenstellend beladen sind. Während thE lange Inkubation im Kühlschrank, der Farbstoff ist gleichmäßig über die Nervenenden verteilt.

Unsere eigenen Beobachtungen 33 , 35 sowie die Daten anderer Forscher 30 beweisen das Fehlen eines nennenswerten Einflusses des Ladevorgangs auf die Amplitude der postsynaptischen Antwort oder auf die Häufigkeit der Miniatur-Endplattenpotentiale. Gute Langlebigkeit wurde in den geladenen Vorbereitungen dokumentiert. Es gibt einige wichtige Punkte, auf die wir uns freuen möchten. Es ist sehr wichtig, den Nervenstumpf innerhalb weniger Minuten nach der Exzision in die Farbstofflade-Lösung zu legen, damit der Farbstoff in die Axone des Schnittnervs eindringen kann; Verzögerungen können eine unwirksame Belastung verursachen, vermutlich aufgrund der Wiederverschließung der Nervenaxone 27 , 36 . Einige Ermittler tauchen den Nervenstumpf in 100 mM EDTA (ein Ca 2+ – und Mg 2+ -Gelator ein) Unmittelbar nach der Exzision des Nervs, um zu verhindern, dass die geschnittenen Axone wieder verschließen. Der Puffer wird nach 1-2 min entfernt und durch eine Farbstoffladelösung 37 ersetzt . Die Verwendung eines Petroleum-Jelly-Well anstelle von Plastikschläuchen für den Ladevorgang ermöglicht die Verwendung eines kürzeren Nervenstumpfes. Bei der Anwendung dieses Ansatzes wird der Nerv geschnitten, nachdem er in die HEPES-Lösung mit Farbstoff eingetaucht ist und die Axone aufgrund des Mangels an zweiwertigen Ionen in der Farbstofflösung 27 , 28 nicht wieder verschließen.

In unserer Studie verwendeten wir die wasserlösliche Salzform des Ca 2+ Indikators anstelle von Dextran. Die Dextran-Konjugate diffundieren im Axon langsamer als die Salzformen. Die Verwendung des Dextran-Konjugats verringert jedoch die Farbstoffkompartimentierung und die Handhabung durch den Nerv und die NMJs. Calcium Green 1-3000 MW Dextran Konjugat hat eine gute Diffusionsrate und zeigt eine reduzierte Kompartimentierung <s Up class = "xref"> 38.

Es ist sehr wichtig, eine lange Zeit der Fluoreszenzbeleuchtung des Gewebes zu vermeiden, weil dies seine Gesundheit und sein Überleben beeinflusst. Wir verwenden Nomarski-Optik im sichtbaren Lichtkanal, um nach Nerven-Terminals zu suchen. Während der Aufnahme beschränken wir das beleuchtete Feld mit einer Membran.

Es ist bemerkenswert, dass diese Belastungsmethode nur für Zubereitungen geeignet ist, die langen Inkubationen standhalten können. Um die Farbstoffbelastungszeit zu reduzieren, wenn Studien an zerbrechlicheren Geweben durchgeführt werden ( z. B. Synapsen von Warmblütern), ist es notwendig, die Nervenstumpflänge zu verkleinern und Mikropipetten zum Beladen zu verwenden 29 , 39 .

Diese Ladetechnik eignet sich hervorragend für die Abbildung von Veränderungen in zytosolischem Ca 2+ mit fluoreszierenden Indikatoren sowohl bei der Nervenstimulation als auch bei der rhythmischen synaptischen AktivitätEf "> 17 , 27 , 35. Die Analyse der Ca 2+ -Transientenamplitude kann verwendet werden, um den Einfluss verschiedener Substanzen auf den Calciumeintrag zu untersuchen, der an der Neurotransmitterfreisetzung 33 beteiligt ist .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde unter dem Programm der Russischen Regierung für das wettbewerbsorientierte Wachstum der Kazan Federal University und ein Stipendium der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983) durchgeführt. Wir danken vier anonymen Rezensenten für hilfreiche Kommentare zu früheren Entwürfen des Manuskripts. Wir danken Yuliya Aratskaya für die Voice Recording. Wir danken Dr. Victor Ilyin für die vielen hilfreichen Kommentare und die Hilfe bei der finale Bearbeitung des Manuskripts.

Materials

Ca2+ indicator Molecular Probes, USA Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 500 μg
Silicone Elastomer Dow Corning, USA Sylgard 184 elastomer
Pipette Biohit, Russia 720210 0.5-10µL
Pipette tip Fisher Scientific, USA 02-707-175 10µL
Pipette tip Biohit, Russia 781349 10µL
Razor Blade Fisher Scientific, USA 12-640
Minutien Pins Fine scince tools, Canada 26002-20
Corneal Mini-Scissors MT MEDI CORP, Canada S-1111
Jeweler Forceps MT MEDI CORP, Canada F-9610
Jeweler Forceps MT MEDI CORP, Canada F-9611
Modelling clay local producer can be replaced by any local producer
Petroleum jelly local producer can be replaced by any local producer
Microspin FV 2400  Biosan, Latva BS-010201-AAA
Multi-spin MSC 3000 Biosan, Latva BS-010205-AAN
Single-use hypodermic needles Bbraun 100 Sterican 0.4×40mm
Syrynge local producer 0.5 ml
HEPES  Sigma-Aldrich, USA H0887 100ml
Microscope, BX51 Olympus, Japan
Stereomicroscope, Leica М80 Leica Microsystems , Germany 
Illumination system Leica CLS 150Х  Leica Microsystems, Germany 
Data acquisition system  Molecular Devices, USA Digitdata 1550
software Molecular Devices, USA pClamp software, Version 10 protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with.
RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro
Bath and bath temperature controler Experimental Builder can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ 
Monochromator Till Photonics, Germany Polychrome V no longer available, can be replaced by other   sutable stable light source 488 nm
monochromator control software Till Photonics, Germany Polycon
Digital CCD camera Redshirt imaging, USA Neuro CCD SMQ
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator A-M Systems, USA
Suction electrode Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. -  2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-
biologicheskix-obektov/
Acquisition software for CCD camera Redshirt imaging, USA Turbo SM software
ImageJ National Institutes of Health, USA http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Spreadsheet program Microsoft, USA Microsoft Office Excel 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (125), e55122, doi:10.3791/55122 (2017).
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