通过神经树桩将钙染料加载到青蛙神经末梢：青蛙神经肌肉接头中的钙瞬态登记

对来自蛙蛙蛙青蛙的肌肉皮肤 斑块的分离神经 – 肌肉制剂进行实验。两性的动物大小约5-9厘米。实验程序按照“喀山联邦大学和喀山医科大学实验动物使用指南”进行，符合NIH“实验动物护理和使用指南”。实验方案符合欧洲共同体理事会指令86/609 / EEC的要求，经喀山医科大学道德委员会批准。 1.准备解决方案 林格氏溶液的制备。 准备林格氏溶液：113.0mM NaCl，2.5mM KCl，3.0mM NaHCO 3和1.8mM CaCl 2 。将pH调节至7.2-7.4。 用低Ca 2+制备林格氏溶液</高Mg 2+含量：113.0mM NaCl，2.5mM KCl，3.0mM NaHCO 3，6.0mM MgCl 2，0.9mM CaCl 2 。将pH调节至7.2-7.4。 染料负载液的制备。 制备含有10mM（pH 7.2-7.4）的HEPES-Na的水溶液。 将14μL的HEPES溶液加入到具有染料30的小瓶中。 注意：Ca 2+指示剂染料在500μL的小瓶中加入500μg粉末。 涡旋旋转，彻底混合。 稀释溶液使Ca 2+指示剂的最终浓度降至30mM。避免暴露于光线并储存在-20°C。 2.染色加载程序 用一块胸大肌神经解剖皮肤肌肉。 注意：解剖程序可用在Blioch 等人的文章的免费下载中，1968 31 。 对于解剖手术，使用两个精细钳子和角膜剪刀（参见表格 ）。将解剖的组织转移到预先填充有林格氏溶液的硅弹性体涂覆的培养皿中，并用精细的不锈钢针固定组织，使其在培养皿中略微拉伸。 用新鲜的等份的林格氏溶液重新填充培养皿。取出结缔组织。不要伤害神经。 准备灌装移液器：使用剃刀刀片，切出标准塑料10μL移液管尖端的圆锥形部分〜2 mm长的一段。 准备一块造型粘土，将填充移液管安装在培养皿上。 将填充移液器的背面连接到塑料注射器，通过硅胶管和由移液器吸头制成的塑料连接适配器。 之前d加载程序，使用塑料移液器从培养皿中取出林格氏溶液。使用精细注射器干燥肌肉 – 神经制剂;这将防止在随后加载灌装移液管时稀释Ca 2+染料。 从冰箱中取出Ca 2+指示剂小瓶，并在室温下在黑暗的地方解冻。 在立体显微镜控制下，低倍率（10×），检测肌肉和神经之间的连接。用精细的镊子和剪刀，将肌肉附近的胸骨神经切开（见步骤2.1）。留下2毫米长的神经残端。 使用造型粘土将连接到管道和注射器上的注射器固定在培养皿上。 移动吸头的尖端靠近神经残端。 不夹住它，轻轻地将神经残端吸入灌装移液管的尖端。 从白中取出吸管t填充移液器的末端。 用长针头的注射器小心地从填充移液管中清除多余的溶液（参见材料表 ）。不要捏住神经残端。 轻轻地垂直抬起填充移液管的尖端，使神经残端吸入尖端。 使用凡士林，从灌装移液管尖端的外部绝缘吸入的神经残端部分。 如果需要，可以将填充移液管中绝缘的神经残基干燥：使用长针头注射器从灌装移液管中轻轻吸出过量的溶液。 使用长吸液管吸头吸取0.5μL染料加载溶液（参见步骤1）。 轻轻地将移液管尖端与装载溶液插入到填充移液器中。将混合物直接喷到神经残端上。 用凡士林密封灌装移液器的开口端。 添加一小块林格的注意培养皿以保持准备湿润。 在黑暗和潮湿条件下室温孵育5小时。 用加载溶液取出填充移液器，用林格氏溶液冲洗准备物质，并在8°C的冰箱中保持过夜。 3.准备显微镜组织将制备物装入硅弹性体涂层室中，并用钢微针固定，使其略微拉伸。 用新鲜的林格氏溶液等份冲洗组织。 使用吸电极刺激神经;电极的构造可从Kazakov 等人免费下载。 ，2015 32 。将电极尖靠近神经的切割端并将神经残端吸入电极孔。 将准备室安装在显微镜平台上。的Plac温度探头和腔室中的入口和出口点火。 将电源线连接到珀耳帖元件。 为了超级准备，请使用简单的重力驱动系统。要清除多余的溶液，请打开灌注抽吸泵。 打开热控制器单元。 将温度控制设置为20°C。 安装紫外线防护罩。 将刺激线电极连接到电刺激器，并用4x物镜观察显微镜下的肌肉收缩。 用低Ca 2+和高Mg 2+含量的林格氏溶液填充灌注系统。 注意：该解决方案用于预防肌肉收缩。外部钙浓度的降低和外部镁的升高导致Ca 2+瞬变幅度的降低。然而，根据以前的经验，将0.9mM CaCl <sub> 2和6mM MgCl 2仍足以可靠地分辨Ca 2+瞬变的幅度。值得一提的是存在一些减少肌肉收缩而不降低Ca 2+浓度的方法。例如，使用d-tubocurarine或α-银环蛇毒素，特异性阻断烟碱乙酰胆碱受体将完全或部分阻断肌肉抽搐17，27，28，30。然而，这些毒素的添加也可以影响突触前钙进入33 。为了避免这种情况，可以使用μ-芋螺毒素GIIIA。 打开泵，并用低Ca 2+和高Mg 2+的林格氏溶液启动制剂的灌注。 在显微镜上切换到40×物镜。 打开t他单色仪（见材料表 ）。 在单色仪控制软件中选择488 nm的发射波长和连续的照明模式。 在高放大倍数的荧光模式下，确保神经末梢装载染料。 图1 ：带有Ca 2+指示剂的神经和终端。 （ A ）装载程序后，神经中装有Ca 2+指示剂。刻度棒= 200μm。 （ B ）充满Ca 2+指示剂的神经末梢。刻度棒=20μm。 （ C ）Ca 2+指示剂荧光在神经末梢清晰可见。刻度棒=20μm。_blank“>请点击此处查看此图的较大版本。 允许制剂在低Ca 2+和高Mg 2+溶液中平衡至少30分钟。 4.采用数字CCD相机进行视频采集注意：捕获荧光信号的细节对于每种显微镜和相机类型都是特定的，但关键考虑的是图像捕获速度。 使用1 kHz作为记录NMJ中单个Ca 2+瞬变的最小捕获频率。 注意：快速数字CCD摄像机是荧光成像所必需的（见材料表 ）。数据采集​​系统和软件（参见“ 材料表” ）用于摄像机，单色仪和刺激器的同步。简而言之，该协议允许在数据的数字输出上产生同步脉冲采集系统打开快门，捕获视频信号，并启动刺激。可以在协议和/或设备上设置所有时间参数。一个典型的协议是一系列以1 kHz（80 x 80像素）获得的500帧。用激发光照射可以漂白Ca 2+指示剂并对细胞组织造成光损伤。因此，避免激发光的长时间曝光。在此协议中，快门仅在拍摄视频所需的时间打开。每个特定神经末梢获取二十个系列。目的是监控对照组和给药后的相同部位。 在显微镜的4X物镜下，使用亮场方式来显现肌肉和神经分支。 切换到40X物镜，使用落射荧光方式和488nm的激发波长，寻找负载染料的神经末梢。确定感兴趣的神经末梢区域。 在三目管of显微镜，选择光路交换等级：100％照相机。 启动CCD摄像机的采集软件。 在“实时”模式下，找到ROI并调整焦点。 选择菜单“更改”设置。 使用“基本配置”，每秒1000帧（fps），分辨率为80 x 80。 将输入帧数设置为500。 输入实验的名称。 选择“外部触发”。 将预触发时间设置为10 ms。 将重复次数设置为20。 在单色仪控制软件中，选择488 nm的发射波长和“外部触发照明”模式。 运行数据采集软件。 加载刺激方案。 在录制视频之前，请使用视频采集软件捕获暗帧。 运行刺激方案。 选择ROI和check记录的信号。 数据分析 NoOTE：对于数据分析，请使用CCD相机软件和ImageJ;数据表示为电子表格程序中的曲线。在CCD相机软件中，平均20次重复并将结果导出到ImageJ支持文件。在ImageJ中，选择ROI和背景。从ROI中减去背景。将数据表示为：（ΔF/ F 0 -1）×100％，其中ΔF是刺激期间的荧光强度，F 0是静止时的荧光强度。 在CCD摄像机的采集软件中，单击文件>平均文件。选择文件并对其进行平均。 将平均文件保存为.fit文件，方法是单击“另存为文件”。 运行ImageJ软件。执行以下步骤： 点击图像>调整>亮度/对比度。 单击图像>堆栈>工具>;堆垛机点击分析>工具>投资回报率管理器。 将平均的.fit文件拖放到ImageJ窗口中。 放大窗口以获得更好的视野。 通过移动光标，选择最后一帧并将其删除（这是黑框） 在被认为是背景的区域上选择一个矩形ROI。将其添加到ROI管理器单击更多>多尺度测量背景。注意平均值。复制数据，将其导出到电子表格程序，并计算一个比率的阈值的平均值。 通过单击“处理”>“主”>“减”，减去堆栈中的阈值。输入阈值的平均值。 在神经末梢周围选择一个矩形ROI。将其添加到ROI管理器。 单击更多>多尺度测量。注意平均值。复制并将其导出到电子表格程序。 平均信号的偏移。 注意：使用第一几十点显示基色染料无刺激;这是休息时的荧光。 将信号除以休息时的荧光。 减去“1”乘以100％。 绘制信号并计算Ca 2+瞬变的幅度。