Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

Поступательное управления становится столь же важным шагом в регуляции транскрипции в экспрессии генов, особенно в периоды клеточного стресса ^1. Координационный центр контроля перевода находится на лимитирующей стадии инициации , где первые этапы синтеза белка связаны с связывание эукариотических фактор инициации 4Е (eIF4E) к 7-methylguanosine (м ⁷ GTP) 5 'колпачка мРНК ² , eIF4E является частью тримера комплекса имени eIF4F , который включает eIF4A, РНК – геликазу и eIF4G, белок строительные леса , необходимого для набора других факторов перевода и 40S рибосомы ^3. В нормальных физиологических условиях, подавляющее большинство мРНК транслируются с помощью механизма кэп-зависимой, но в периоды клеточного стресса приблизительно 10% человеческих мРНК содержит 5 'НТО , которые могли бы позволить кэп-независимый перевод инициация ^1,4. Cap-зависимый перевод был исторически синонимOUs с eIF4F, однако, стресс-специфические вариации eIF4F стали трендом тема ^5-8.

Различные клеточные стрессы вызывают eIF4E активность, чтобы быть подавлено через мишень рапамицина у млекопитающих комплекса 1 (mTORC1). Эта киназа становится нарушение в условиях стресса, что приводит к увеличению активности одной из своих целей, то 4E-связывающий белок (4E-BP). Нефосфорилированный 4E-BP связывается с eIF4E и блокирует его способность взаимодействовать с eIF4G вызывает репрессию кэп-зависимой трансляции ^9,10. Интересно отметить , что гомолог eIF4E по имени eIF4E2 (или 4EHP) имеет значительно более низкое сродство к 4E-BP ^11, может быть , что позволяет ему уйти от стресса опосредованной репрессии. Действительно, первоначально характеризуется как репрессор перевода из – за отсутствия взаимодействия с eIF4G ^12, eIF4E2 инициирует перевод сотен мРНК , которые содержат РНК – элементы ответа гипоксия в их 3 'UTR во время гипоксического стресса ^6,13. Эта активация яы достигается за счет взаимодействия с eIF4G3, РНК связывающий белок мотив 4 и индуцируемого гипоксией фактор (HIF) 2Л составлять гипоксической eIF4F комплекс, или eIF4F ^{H 6,13.} В качестве репрессора при нормальных условиях, eIF4E2 связывается с GIGYF2 и ZNF598 ^14. Эти комплексы были, в частности, определены через Агарозном-сцепленных м ⁷ GTP аффинных смол. Этот классический метод ¹⁵ является стандартом в области перевода и является лучшим и наиболее часто используемый метод для выделения кэп-связывающих комплексов в выдвиньте вниз и в пробирке анализы связывания ^16-19. По мере того как крышка-зависимого перевода машины появляется как гибкость и адаптируемость с интер изменяющие деталей ^6-8,13, этот метод является мощным инструментом для быстрого выявления новых кэп-связывающих белков , участвующих в реакции на стресс. Кроме того, изменения в eIF4F может иметь далеко идущие последствия, как несколько эукариотических систем модели появляются использовать гомолог eIF4E2 для таких стрессовых реакцийкак A. thaliana ^20, С. Pombe ^21, Д. MELANOGASTER ^22, и С. Элеганс ^23.

Имеющиеся данные свидетельствуют о том , что изменения в eIF4F не может быть строго ограничена стрессовым условиям, но участвовать в нормальной физиологии ^24. Подача кислорода к тканям (на концах капилляра) или в тканях (измеряется с помощью микроэлектродов) колеблется от 2-6% в головном мозге ^25, 3-12% в легких ^26, 3,5-6% в кишечнике ^27, 4% в печень ^28, 7-12% в почке ^29, 4% в мышцах ^30, и 6-7% в костном мозге ^31. Клетки и митохондрии содержат менее 1,3% кислорода ^32. Эти значения гораздо ближе к гипоксии, чем окружающий воздух, где клетки обычно культивируют. Это говорит о том, что ранее считалось, как гипоксия специфические клеточные процессы, которые могут быть необходимы в физиологической обстановке. Интересно, что eIF4F и eIF4F ^H </suр> активно участвуют в инициации трансляции различных пулов или классов мРНК в нескольких различных клеточных линий человека , подвергшихся воздействию физиологического кислорода или "physioxia" ^24. Низкий уровень кислорода также приводит правильное развитие плода ³³ и клетки обычно имеют более высокий уровень пролиферации, увеличенный срок службы, меньше повреждений ДНК и меньше ответов общего напряжения в physioxia ^34. Поэтому eIF4F ^H, вероятно , является ключевым фактором в экспрессии генов , выбранных в физиологических условиях.

Здесь мы приводим протокол к культуре клеток в основных физиологических условиях кислорода или в динамическом диапазоне колеблющейся, который, вероятно более представительным микросреды ткани. Одно из преимуществ этого способа состоит в том, что клетки лизируют в пределах рабочей станции гипоксией. Не так часто, ясно, как переход от гипоксического культуры клеток к лизису клеток производится в других протоколах. Клетки часто сначала удаляют из небольшого гипоксией инкубаторе бытьпередний лизис, но это воздействие кислорода может влиять на биохимические пути , как клеточная реакция с кислородом происходит быстро (один или два мин) ^35. Некоторые кэп-связывающие белки требуют взаимодействия с вторым основанием или может гидролизовать м ⁷ ГТФ, поэтому некоторые крышки interactors могут быть пропущены в процессе очистки. Агарозном связаны с аналогами ферментативно резистентных Колпачок может быть заменен в данном протоколе. Изучение активности и состава eIF4F ^H и других вариаций eIF4F с помощью метода , описанного здесь будет пролить свет на запутанные экспрессии генов механизмов , которые клетки используют в процессе физиологических условиях или стрессовых реакций.