Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
ट्रांसलेशनल नियंत्रण जीन अभिव्यक्ति में transcriptional विनियमन के लिए एक समान रूप से महत्वपूर्ण कदम के रूप में उभर रहा है, विशेष रूप से सेलुलर तनाव 1 की अवधि के दौरान। अनुवाद नियंत्रण का केन्द्र बिन्दु दीक्षा की दर सीमित कदम (एम 7 जीटीपी) 5 'mRNAs 2 की टोपी जहां प्रोटीन संश्लेषण के पहले चरण 7-methylguanosine को यूकेरियोटिक दीक्षा कारक 4E (eIF4E) के बंधन को शामिल में है । eIF4E एक trimeric eIF4F नामित जटिल है कि eIF4A, एक शाही सेना helicase, और eIF4G, एक मचान प्रोटीन अन्य कारकों अनुवाद और 40 राइबोसोम 3 की भर्ती के लिए आवश्यक भी शामिल है का हिस्सा है। सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, mRNAs के विशाल बहुमत एक टोपी पर निर्भर तंत्र के माध्यम से अनुवाद कर रहे हैं, लेकिन सेलुलर तनाव के समय के तहत मानव mRNAs का लगभग 10% 5 'UTRs कि 1,4 intiation टोपी स्वतंत्र अनुवाद की अनुमति दे सकता है होते हैं। कैप पर निर्भर अनुवाद ऐतिहासिक पर्याय किया गया हैous eIF4F साथ, तथापि, eIF4F के तनाव-विशिष्ट रूपों एक trending विषय 5-8 बन गए हैं।
विभिन्न सेलुलर तनाव का कारण eIF4E गतिविधि rapamycin जटिल 1 (mTORC1) के स्तनधारी लक्ष्य के माध्यम से दमित किया जाना है। इस काइनेज तनाव है, जो अपने लक्ष्यों में से एक की वृद्धि की गतिविधि में परिणाम के तहत भ्रष्ट हो जाता है, 4E बाध्यकारी प्रोटीन (4E-बीपी)। गैर-फॉस्फोरिलेटेड 4E-बीपी eIF4E और ब्लॉक करने के लिए eIF4G टोपी पर निर्भर अनुवाद 9,10 के दमन के कारण के साथ बातचीत करने के लिए अपनी क्षमता को बांधता है। दिलचस्प बात यह है eIF4E की एक Homolog eIF4E2 (या 4EHP) का नाम शायद यह तनाव की मध्यस्थता दमन से बचने के लिए अनुमति देता है, 4E-बीपी 11 के लिए एक बहुत कम संबंध है। दरअसल, शुरू में eIF4G 12 के साथ बातचीत की कमी के कारण अनुवाद का एक repressor के रूप में होती, eIF4E2 hypoxic तनाव 6,13 दौरान mRNAs है कि उनके 3 'UTR में शाही सेना हाइपोक्सिया प्रतिक्रिया तत्व होते सैकड़ों की बात शुरू की। इस सक्रियण मैंeIF4G3, आरएनए प्रोटीन मूल भाव 4, और हाइपोक्सिया inducible कारक (HIF) 2α बाध्यकारी एक hypoxic eIF4F जटिल है, या eIF4F एच 6,13 का गठन करने के साथ बातचीत के माध्यम से प्राप्त कर रहा है। सामान्य परिस्थितियों में एक repressor के रूप में, eIF4E2 GIGYF2 और ZNF598 14 के साथ बांधता है। इन परिसरों थे, भाग में, agarose से जुड़े एम 7 जीटीपी समानता रेजिन के माध्यम से पहचान की। इस क्लासिक विधि 15 अनुवाद के क्षेत्र में मानक है और सबसे अच्छा और सबसे अधिक तकनीक का इस्तेमाल नीचे खींचने में टोपी बाध्यकारी परिसरों को अलग करने के लिए और इन विट्रो में बाध्यकारी assays 16-19 है। टोपी पर निर्भर अनुवाद मशीनरी के रूप में लचीला और अंतर-बदलते भागों 6-8,13 साथ अनुकूलनीय में उभर रहा है के रूप में, इस विधि तेजी से उपन्यास टोपी बाध्यकारी तनाव की प्रतिक्रिया में शामिल प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इसके अलावा, eIF4F में बदलाव व्यापक प्रभाव पड़ सकता है कई यूकेरियोटिक मॉडल प्रणाली तनाव प्रतिक्रियाओं इस तरह के लिए एक eIF4E2 homolog का उपयोग करने के रूप में प्रकटए thaliana 20 के रूप में, एस पोम्ब 21, डी मेलानोगास्टर 22, और 23 सी एलिगेंस।
सबूत बताते हैं कि eIF4F में बदलाव सख्ती से तनाव की स्थिति है, लेकिन सामान्य शरीर क्रिया विज्ञान 24 में शामिल किया जा सीमित नहीं किया जा सकता है। (केशिका सिरों पर) या ऊतकों के भीतर ऊतकों को ऑक्सीजन की आपूर्ति (microelectrodes के माध्यम से मापा जाता है) मस्तिष्क 25 में 2-6% से भिन्न होता है, फेफड़ों 26 में 3-12%, आंत 27, 4% में 3.5-6% जिगर 28, गुर्दे की 29 में 7-12%, मांसपेशियों में 30 में 4%, और अस्थि मज्जा 31 में 6-7%। कोशिकाओं और माइटोकॉन्ड्रिया 1.3% ऑक्सीजन 32 की तुलना में कम होते हैं। इन मूल्यों को बहुत परिवेशी वायु जहां कोशिकाओं को नियमित सुसंस्कृत हैं की तुलना में हाइपोक्सिया के करीब हैं। यह पता चलता है कि क्या पहले के रूप में हाइपोक्सिया-विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं एक शारीरिक सेटिंग में प्रासंगिक हो सकता है लगा रहे थे। दिलचस्प बात यह है eIF4F और eIF4F एच </sup> सक्रिय रूप से शारीरिक ऑक्सीजन या "physioxia" 24 से अवगत कराया कई अलग अलग मानव कोशिका लाइनों में अलग पूल या mRNAs की कक्षाओं का अनुवाद दीक्षा में भाग लेते हैं। कम ऑक्सीजन भी उचित भ्रूण के विकास 33 ड्राइव और कोशिकाओं को आम तौर पर उच्च प्रसार दर, अब जीवनकाल, कम डीएनए की क्षति और कम physioxia 34 में सामान्य तनाव प्रतिक्रियाओं की है। इसलिए, eIF4F एच संभावना शारीरिक शर्तों के तहत चुनिंदा जीनों की अभिव्यक्ति में एक महत्वपूर्ण कारक है।
यहाँ, हम तय शारीरिक ऑक्सीजन की स्थिति में या एक गतिशील अस्थिर रेंज ऊतक microenvironments की संभावना अधिक प्रतिनिधि है कि संस्कृति की कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस पद्धति का एक लाभ यह है कि कोशिकाओं हाइपोक्सिया कार्य केंद्र के भीतर lysed रहे हैं। यह कैसे सेल को hypoxic सेल संस्कृति से संक्रमण अन्य प्रोटोकॉल में किया जाता है स्पष्ट अक्सर नहीं है। प्रकोष्ठों अक्सर पहले एक छोटे से हाइपोक्सिया इनक्यूबेटर से हटा रहे होसामने सेल, लेकिन ऑक्सीजन को यह जोखिम जैव रासायनिक रास्ते को प्रभावित कर सकता है के रूप में ऑक्सीजन के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया तेजी से (एक या दो मिनट) 35 है। कुछ टोपी बाध्यकारी प्रोटीन एक दूसरे के साथ बातचीत के आधार की आवश्यकता होती है या एम 7 जीटीपी, इसलिए कुछ टोपी interactors शुद्धिकरण की प्रक्रिया में याद किया जा सकता hydrolyze कर सकते हैं। Agarose से जुड़े enzymatically प्रतिरोधी टोपी analogs करने के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रतिस्थापित किया जा सकता है। यहाँ वर्णित विधि के माध्यम से गतिविधि और eIF4F एच और eIF4F के अन्य रूपों की संरचना की खोज जटिल जीन अभिव्यक्ति मशीनरी है कि कोशिकाओं को शारीरिक शर्तों या तनाव प्रतिक्रियाओं के दौरान उपयोग पर प्रकाश डाला जाएगा।
शारीरिक ऑक्सीजन की स्थिति से अवगत कराया मानव कोशिकाओं में टोपी बाध्यकारी प्रोटीन का विश्लेषण उपन्यास ऑक्सीजन विनियमित अनुवाद दीक्षा कारकों की पहचान के लिए अनुमति दे सकते हैं। लिंक्ड जीटीपी agarose मोती…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |