Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
Translationel kontrol fremstår som en lige så vigtig skridt til transkriptionel regulering i genekspression, især i perioder med cellulært stress 1. En omdrejningspunktet for oversættelse kontrol er det hastighedsbegrænsende trin i indledningen, hvor de første skridt i proteinsyntese involverer binding af den eukaryote indledning faktor 4E (eIF4E) til 7-methylguanosin (m 7 GTP) 5 'cap af mRNA'er 2 . eIF4E er en del af en trimert kompleks opkaldt eIF4F der omfatter eIF4A, en RNA helicase, og eIF4G, et stillads protein kræves for rekruttering af andre oversættelse faktorer og 40S ribosom 3. Under normale fysiologiske betingelser, er det store flertal af mRNA oversættes via en cap-afhængig mekanisme, men under perioder med cellulære stress ca. 10% af de menneskelige mRNA indeholder 5 'UTR'er der kan tillade cap-uafhængig oversættelse intiation 1,4. Cap-afhængige oversættelse har været historisk synonymskellige med eIF4F dog stress-specifikke variationer af eIF4F er blevet et trending emne 5-8.
Forskellige cellulære belastninger forårsager eIF4E aktivitet, der skal undertrykkes via pattedyr mål for rapamycin kompleks en (mTORC1). Denne kinase bliver forringet under stress, hvilket resulterer i forøget aktivitet af et af sine mål, den 4E-bindende protein (4E-BP). Ikke-phosphoryleret 4E-BP binder sig til eIF4E og blokerer dens evne til at interagere med eIF4G forårsager undertrykkelse af cap-afhængige oversættelse 9,10. Interessant, en homolog af eIF4E opkaldt eIF4E2 (eller 4EHP) har en meget lavere affinitet for 4E-BP 11, måske gør det muligt at omgå stress-medieret repression. Faktisk oprindeligt karakteriseret som en repressor af oversættelse på grund af sin mangel på interaktion med eIF4G 12, eIF4E2 indleder oversættelse af hundredvis af mRNA, der indeholder RNA hypoxi respons elementer i deres 3'UTR under hypoxisk stress 6,13. Denne aktivering iS opnåede gennem interaktioner med eIF4G3, RNA-bindende protein-motiv 4, og hypoxi inducerbar faktor (HIF) 2α at udgøre en hypoxisk eIF4F kompleks eller eIF4F H 6,13. Som en repressor under normale forhold, eIF4E2 binder med GIGYF2 og ZNF598 14. Disse komplekser blev delvist identificeret ved agarose-bundne m 7 GTP affinitetsresiner. Denne klassiske metode 15 er standard inden for oversættelse og er de bedste og mest anvendte teknik til at isolere cap-bindende komplekser i pull ned og in vitro bindingsassays 16-19. Da hætten-afhængige oversættelse maskiner er på vej som fleksibel og tilpasningsdygtig med indbyrdes skiftende dele 6-8,13, denne metode er et stærkt værktøj til hurtigt at identificere nye cap-bindende proteiner involveret i stress respons. Endvidere kunne variationer i eIF4F har brede implikationer, da flere eukaryote modelsystemer synes at bruge en eIF4E2 homolog til stressreaktioner sådannesom A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, og C. elegans 23.
Meget tyder på, at variationer i eIF4F ikke kan begrænses til stress betingelser, men være involveret i normal fysiologi 24. Iltforsyning til vævene (ved kapillære ender) eller inden væv (målt via mikroelektroder) varierer fra 2-6% i hjernen 25, 3-12% i lungerne 26, 3,5-6% i tarmen 27, 4% i leveren 28, 7-12% i nyrerne 29, 4% i muskel 30, og 6-7% i knoglemarven 31. Celler og mitokondrier indeholder mindre end 1,3% oxygen 32. Disse værdier er meget tættere på hypoxi end den omgivende luft, hvor celler dyrkes rutinemæssigt. Dette antyder, at hvad der tidligere blev opfattet som hypoxi-specifikke cellulære processer kan være relevant i en fysiologisk indstilling. Interessant eIF4F og eIF4F H </sup> deltage aktivt i oversættelsen initiering af distinkte puljer eller klasser af mRNA i flere forskellige humane cellelinjer udsat for fysiologisk ilt eller "physioxia" 24. Lav ilt driver også korrekt fosterudvikling 33 og celler generelt har højere spredning satser, længere livslængde, mindre DNA skader og færre generelle stressreaktioner i physioxia 34. Derfor eIF4F H sandsynligvis en nøglefaktor i ekspression af udvalgte gener under fysiologiske betingelser.
Her giver vi en protokol til kultur celler i faste fysiologiske iltforhold eller i en dynamisk svingende område, der er sandsynligvis mere repræsentativ for væv mikromiljøer. En fordel ved denne fremgangsmåde er, at cellerne lyseres i hypoxi arbejdsstation. Det er ikke ofte klart, hvordan overgangen fra hypoksisk cellekultur til cellelyse udføres i andre protokoller. Celler ofte først fjernes fra en lille hypoxi inkubator væreforgrunden lysis, men denne eksponering til oxygen kan påvirke biokemiske veje som det cellulære respons på oxygen er hurtig (en eller to min) 35. Visse cap-bindende proteiner kræver interaktioner med en anden base eller kan hydrolysere m 7 GTP, kan derfor glip af nogle cap interaktionskandidater i rensningsprocessen. Agarose-forbundet til enzymatisk resistente cap-analoger kan erstattes i denne protokol. Udforskning af aktivitet og sammensætningen af eIF4F H og andre variationer af eIF4F gennem den her beskrevne metode vil kaste lys over de indviklede genekspression machineries at celler udnytter under fysiologiske betingelser eller stressreaktioner.
Analysen af cap-bindende proteiner i humane celler eksponeret for fysiologiske iltindhold kan åbne mulighed for identifikation af nye oxygen-regulerede translationsinitierings- faktorer. Affiniteten af disse faktorer for 5'-cap af mRNA eller andre cap-associerede proteiner kan måles ved styrken af deres tilknytning til m 7 GTP-bundet agaroseperler. En advarsel ved denne teknik er, at den måler cap-bindende potentiale af proteiner efter lyse, men den udføres under ikke-denaturerende betingelser, …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |