This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced “on-a-chip” devices.
Denne detaljerte protokollen beskriver gjennomføring av bildestyrt, laser-baserte hydrogel degradering for fabrikasjon av kar-avledede microfluidic nett innleiret i PEGDA hydrogeler. Her beskriver vi etablering av virtuelle masker som gir mulighet for bildestyrt laser kontroll; den fotopolymeriserings av en micromolded PEGDA hydrogel, egnet for mikrofluid nettverk fabrikasjon og presset hodet drevet flyt; oppsett og bruk av en kommersielt tilgjengelig laser scanning konfokalmikroskop paret med en femtosecond pulset Ti: S laser for å indusere hydrogel degradering; og avbildning av fabrikkerte microfluidic nettverk ved hjelp av fluorescerende arter og konfokal mikroskopi. Mye av protokollen er fokusert på korrekt oppsett og gjennomføring av mikroskop programvare og mikroskop makro, da disse er avgjørende skritt i å bruke en kommersiell mikroskop for microfluidic fabrikasjon formål som inneholder en rekke vanskelighetene. Den bildestyrt del av denne teknikk;e åpner for gjennomføring av 3D bildestakker eller brukergenererte 3D-modeller, og dermed åpner for kreative mikrofluid design og for fabrikasjon av komplekse microfluidic systemer av nesten enhver konfigurasjon. Med en forventet effekt i tissue engineering, kan metodene som er skissert i denne protokollen hjelp i fabrikasjon av avanserte biomimetic microtissue konstruksjoner for orga- og menneske-on-a-chip-enheter. Ved å etterligne kompleks arkitektur, tortuosity, størrelse og tetthet av in vivo blodkar, kan essensielle biologiske transportprosesser bli kopiert i disse konstruksjonene, som fører til mer nøyaktig in vitro modellering av narkotika farmakokinetikk og sykdom.
Det vaskulære system, bestående av både lymfatisk og cardiovasculature, danner svært tett nettverk som er avgjørende for transport av næringsstoffer og oksygen og for fjerning av metabolsk avfall. Følgelig celler som befinner seg i vaskulariserte vev er aldri mer enn 50-100 um bort fra et fartøy 1. Evnen til å reprodusere in vivo vaskulær arkitektur in vitro er kritisk for nøyaktig modellere in vivo transportprosesser som benytter modifiserte konstruksjoner. Med en fersk kjøretur for å utvikle organ-on-a-chip enheter 2 for high-throughput narkotika screening 3,4 og sykdom modellering 5,6, metoder skape microfluidic nettverk som rekapitulere in vivo -lignende transport i syntetiske eller naturlige hydrogeler tegner betydelig interesse. For å forbedre biomimicry av microtissues brukes i disse enhetene, har vi utviklet en bildestyrt, laser-baserte hydrogel degradering metode som benytter tredimensjonall (3D) bilde stabler av innfødte blodkar som maler for å generere vaskulære-avledet microfluidic nettverk innebygd i PEGDA hydrogeler 7. Denne protokollen beskriver bruk av en kommersielt tilgjengelig laser-scanning confocal mikroskop utstyrt med en femtosecond pulset laser for å dikte vaskulære-avledet, biomimetic microfluidic nettverk i PEGDA hydrogeler via bildestyrt, laserbaserte degradering.
Dagens tilnærminger til å fluid hydrogeler inkludere induksjon av vaskulær 8-10 eller angiogene 10-12 endotelceller selv montering og microfabrication teknikker for å lage forhåndsdefinerte kanaler for endotelialisering 13-16. Selv om selv montert nettverk rekapitulere tetthet og kompleks arkitektur av microvasculature, de er ofte mer gjennomtrengelig enn in vivo nettverk 11,17,18, som kan være problematisk i modellering transport for narkotika screening-programmer. Selv montert nettverk består av physiologmatisk relevant, kapillær store fartøy, men de kan være vanskelig å integrere med bulk væskestrømmen på grunn av begrensninger i å generere større arteriole store fartøy. Så det er ingen direkte kontroll over monteringen av disse nettverkene, kan den endelige arkitektur variere fra prøve til prøve, noe som gjør det vanskelig å gjentatte ganger produsere nettverk med de samme strømnings og transportegenskaper.
For å generere 3D, hydrogel-embedded microfluidic nettverk med repeterbare geometri og veldefinert arkitektur, har en rekke microfabrication teknikker blitt utviklet, inkludert modulær montering 13, 3D printing av offer materialer 16, direkte skrive montering 14, og rundstrålende trykking 15. Bruk av disse metodene, mikrofluid arkitektur, og derfor strømnings og transportegenskaper, kan gjentatte ganger fabrikkert over mange konstruksjoner. En vesentlig begrensning av disse metodene er imidlertid den manglende evne til å lage microfluidic nettverk med kapillære store funksjoner, 4 til 10 mikrometer 19. De fleste microfabrication teknikker er ofte begrenset til funksjoner som strekker seg 150 til 650 pm i diameter 13,16. Noen eksisterende teknikker er istand til å generere hierarkiske nettverk med kanaler over et bredt diameterområde, 10 til 300 um for direkte-skriveenheten 14, og 18-600 um for rundtstrålende utskrift 15, men de er begrenset i deres evne til å generere tett nettverk eller til å produsere flere microfluidic nett i umiddelbar nærhet innenfor en enkelt konstruksjon 7.
For å overvinne noen av disse begrensningene, har vi utviklet en bildestyrt, laser-baserte hydrogel degradering teknikk som gjør at repeterbare fabrikasjon av biomimetic, hierarkiske microfluidic nettverk som rekapitulere arkitekturen i in vivo microvasculature. For å gjøre dette, en 790 nm, 140 femtosecond (fs) pulset laser som opererer på 80 MHz er raster-skannet in ønskede 3D-steder i en hydrogel, slik det er definert ved bilder av in vivo vaskulatur. Vi spekulerer i at nedbrytningsprosessen opererer gjennom laser-indusert optisk nedbrytning av vann, den resulterende plasmadannelsen, den påfølgende rask thermoelastic ekspansjon av vann, og den lokale forringelse av hydrogel som vannet utvider seg 20. Denne mekanismen varierer litt fra laserbaserte nedbrytning av protein-baserte hydrogeler 21-24. I motsetning til PEGDA, som har en lav multiphoton tverrsnitt, proteiner har ofte et stort multiphoton tverrsnitt og derfor degraderes via en multiphoton absorpsjon-indusert kjemisk brudd 23. For å generere bildeveiledet microfluidic nettverk, laser lukker kontrollert av bilde-avledet virtuelle masker, som består av en mosaikk av områder av interesse ni som definerer microfluidic arkitektur. Ved hjelp av denne tilnærmingen, har vi vist evne til å dikte 3D vaskulær-avledet biomimetic microfluidic nettverk, som rekapitulere den tette og kroket arkitektur av in vivo vaskulatur, for å lokalt styre porøsiteten av hydrogeler ved å endre mengden av energi som leveres ved nedbrytning. Vi har også vært i stand til å generere to uavhengige microfluidic nettverk som fletter i umiddelbar nærhet (15 mm), men aldri direkte kobler 7. Vi har også vist evnen til endothelialize laser-degradert mikrokanaler gjennom stolpen degradering funksjonalisering med integrin ligere peptidsekvensen, Arginine-Glycine-Aspartic Acid-serin (RGDS), for å fremme endotelial celleadhesjon og lumen formasjon 7.
Med denne protokollen, er generering av komplekse microfluidic nettverk i PEGDA hydrogeler gjort mulig via bildestyrt, laserbaserte nedbrytning ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig mikroskop tilgjengelig på mange universitetsområder. Som nedbrytingsprosessen er styrt av digitale, virtuelle masker, dette fabricasjon teknikk er mottagelig for den kreative utformingen av microfluidic nettverk, slik at dens anvendelse i en lang rekke anvendelser. Vi forventer at metoden som er beskrevet her vil være mest fordelaktig i å utforme biomimetic orga- og menneske-on-a-chip enheter i stand til å replikere biologiske transportprosesser viktige i modellering narkotika transport 2. Dette fabrikasjon teknikken kan også være av interesse for generering av in vitro sykdomsmodeller, blant annet kreft metastaser 5,6 og blod-hjerne barrieren modeller 25. Som laser-baserte hydrogel degradering har tidligere blitt brukt til å lage spor for veiledning av nevronale utvekst 21-23, kan bildestyrt forlengelse av denne teknikken være nyttig i avanserte tissue engineering strategier for å posisjonere celler i brukerdefinerte 3D romlige ordninger.
Kritisk i overstyrer standardfunksjoner i mikroskop programvare for å muliggjøre bruk av virtuelle masker for bildestyrt, laserbaserte degradering, må mikroskop makro være oppsett og manipulert nøye. Hvordan mikroskop programvaregrensesnitt med mikroskop makro kan noen ganger være counterintuitive, og mye innsats ble investert i å bestemme de optimale innstillingene i begge programmer for å utvikle denne metoden. En generell forståelse av grunnleggende laserskanning konfokalmikroskop bruk anbefales, særlig med "Stage" og "Focus" vinduer for å finne og korrekt posisjonering av hydrogel i x-, y- og z-dimensjoner, før du prøver laserbaserte degradering. Dessuten er fremstillingen av en innløpskanal kritisk for protokollen; suspenderte fluorescerende arter må kunne gå inn i microfluidic systemer for vellykket bildebehandling og nettverk karakterisering. Det er viktig å merke seg at denne protokollen gjelder for en bestemt laser-scanning konfokalmikroskop konfigurert med en bestemt femtosecond pulset laser, kjører spesifikke versjoner av mikroskop programvare og mikroskopet makro (se detaljer i Liste over spesifikke materialer / utstyr). Vi har oppdaget at nyere versjoner av mikroskop makro mangler den nødvendige kontroll og funksjonalitet som trengs for bildestyrt laser kontroll. Mens andre mikroskop plattformer og pulsede laserkilder kan benyttes, gjelder denne protokollen spesielt til dette systemet og vil trenge modifisering i henhold til plattformen, laserkilden, og software implementert. De underliggende prinsippene i hele denne protokollen gjelder fortsatt, men.
En potensiell modifikasjon til denne protokollen innebærer endring av hydrogel sammensetning. Her benyttet vi 5 vekt%, 3,4 kDa PEGDA hydrogeler, men laserbaserte nedbrytning (for formål bortsett fra microfluidic nettverk generasjon) har blitt iverksatt for å fornedre både syntetiske og naturlige hydrogeler, inkludert PEGylert fibrinogen 21,22, hydrogeler silke proteiner 23, og kollagen 24. Justering av lasereffekt, skannehastighet, avstanden mellom Z-skiver, og antallet gjentakelser vil hjelpe til å bestemme de optimale parameterne for å fremstille microfluidic nettverk i andre hydrogel-formuleringer.
En strømbegrensning av teknikken er det samlede volumet av hydrogel som kan bli degradert i en mulig tid. Å skape åpne hulrom eller microfluidic funksjoner i hydrogel, laser dvele tiden må være på eller over 8,96 ms / pixel (eller en laserskannehastighet på 0,021 mikrometer / ps) ved bruk av en laser fluens på 37,7 nJ / mikrometer to. Med disse innstillinger, tar det 1,4 timer for å nedbryte fartøyer innenfor en 0,014 mm 3 volum (som sett i figur 1). Ved hjelp av en laser oppholdstid på 4,48 us / pixel eller under, er den energi som leveres ikke er nok for fullstendig nedbrytning av den hydrogelformulering som brukes her. Implementering av en annen hydrogelsammensetning kan overvinne denne begrensningen. Bruken av fotolabile gels som inneholder lysfølsomme komponenter 34-36 eller hydrogel som har stor multiphoton tverrsnitt 21-24 er gode alternativer som vil muliggjøre bruk av mindre energi og vil resultere i raskere nedbrytning. Med hensyn til dimensjonsbegrensninger, har funksjoner blitt fabrikkert opp til 1,5 mm dypt i hydrogel 7. Dybden kan oppnås er en funksjon av arbeidsavstanden til målet, og kan økes ved hjelp av ultra-lang arbeidsavstand mål optimalisert for in vivo avbildning. Den minste målt kanal 7 opprettet med en 20X (NA1.0) vann nedsenking objektiv hadde en bredde på 3,3 m og dybde på 8,9 mikrometer, som er på nivå med størrelsen på de minste kanalene som genereres i figur 1. Mens andre laboratorier har brukt lavere NA mål 21,23,24, forventer vi at microfluidic nettverk med mindre funksjoner kan genereres ved hjelp av høyer NA mål på bekostning av en redusert arbeidsavstand. Til syvende og sist, men er oppløsningen av teknikken en funksjon av punktspredefunksjonen for fokusert laserstråle, laserskannings egenskaper, mengden av energi som leveres av laseren, og laser absorpsjons-egenskapene til materialet som blir degradert.
Videre laser egenskaper (hastighet, fluence, avstanden mellom virtuelle masker, og antall repetisjoner) må optimaliseres på grunnlag av hydrogel-egenskaper (tverrbindingsdensitet, makromer / monomer molekylvekt, vektprosent, og typen av hydrogel og protein-baserte syntetiske vs. ), da disse vil i seg selv forandre interaksjon med laseren og således den endelige oppløsning av prosessen. Som energi levert er også påvirket av objektiv brukes, er ytterligere optimalisering nødvendig når du bytter mellom målene. Med hensyn til kostnader involvert, er tilgang til et mikroskop med en pulset laser nødvendig, og mens mange forskjellige målsettingerter kan anvendes, de med en høy NA og lang rekkevidde (for in vivo avbildning) kan være kostbart.
Utover protokollen beskrevet her, kan microfluidic nettverk generert ved hjelp av denne teknikken også funksjon med celle-lim peptider post-kanal fabrikasjon å indusere endotelcelle adhesjon og lumen dannelse 7. I tillegg kan inkorporering av celle-nedbrytbart peptid-sekvenser i bulkmaterialet 9 før kanalisere degradering muliggjøre studier av cellemigrering inn i og gjennom hydrogel. For kontinuerlig fluidisering av mikrofluid nettverk inne i hydrogelen, kan hydrogeler bli fotopolymerisert i større fluid enheter eller hus, som vist i figurene 2 og 3 7.
Den generasjonen av vaskulære nettverk via vaskulær eller angiogen selvbygging 8-12 gir en grei tilnærming til å indusere vascularization gjennom et forholdsvis stort volum hydrogel. Mens denne tilnærmingen resulterer i perfusable fluid nettverk, er det vanskelig å direkte kontrollere størrelsen, tortuosity, tetthet, og generelt nettverksarkitektur. På grunn av denne begrensning kan strømningsprofilen og skjærhastigheter i vaskulaturen varierer mellom eksperimenter. Alternativt microfabrication teknikker 13-16 tillate for direkte kontroll over nettverket arkitektur, men er ofte begrenset av deres manglende evne til å generere små kapillære store kanaler eller fabrikasjon av tette nettverk som etterligner in vivo vaskulær arkitektur. Mens laser-baserte hydrogel degradering teknikk skissert her har nylig blitt gjenbrukes microfluidic generasjon, overvinner det samtidig både arkitektonisk kontroll og størrelse baserte begrensningene i eksisterende microfabrication metoder ved å aktivere etablering av 3D biomimetic microfluidic nettverk som rekapitulere tettheten, tortuosity, størrelse område, og samlet architecture av in vivo vaskulatur. Videre kan flere fluid nettverk bli generert i en enkelt hydrogel, slik at studiet av nettovergripende transport 7. For tissue engineering applikasjoner som streber etter å nærmere replikere in vivo transportprosesser in vitro, de svært løst hydrogel-embedded microfluidic nettverk skissert her er godt egnet. Vi forventer at denne protokollen vil være nyttig i utviklingen av vev konstruksjoner som mer nøyaktig etterligne in vivo transport for bruk som narkotika screening og in vitro sykdomsmodeller.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Jeff Caplan and Mr. Michael Moore at the Delaware Biotechnology Institute Bio-Imaging Center for their support with confocal microscopy. Access to microscopy equipment was supported by the National Institutes of Health (NIH) shared instrumentation grants (S10 RR0272773 and S10 OD016361) and the State of Delaware Federal Research and Development Grant Program (16A00471). This research was supported by grants from the Institutional Development Award (IDeA) from the NIH National Institute of General Medical Sciences (P20GM103446), the American Cancer Society (14-251-07-IRG), the University of Delaware Research Foundation (14A00778), the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) (RR140013), and the NIH National Library of Medicine (4 R00 LM011390-02).
MATLAB | Mathworks | R2015a | named "programming software" in protocol; refer to source 9 for details on algorithm |
FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | version 1.51a | named "image processing software" in protocol |
LSM 780 Confocal Microscope | Zeiss | named "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogel degradation | |
Zen 2010B SP1 | Zeiss | release version 6.0 | named "microscope software" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 |
Multitime, 2010 | Zeiss | v16.0 | named "microscope macro" in protocol; for use on Zeiss LSM-780 (in conjunction with Zen) |
Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC D=0.17 M27 75mm | Zeiss | 421452-9880-000 | for use on Zeiss LSM-780 |
Chameleon Vision II Modelocked Ti:S Laser | Coherent | named "high-powered pulsed laser" in protocol | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Triethanolamine (TEOA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | flammable; skin and eye irritant; work with in a fume hood |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
150 mL Vacuum Filtration Cups with 0.2 µm PES Membrane | VWR | 10040-460 | |
PEGDA | synthesized in house | refer to source 33 for synthesis methods; store under argon | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | store under argon; carcinogenic; work with in a fume hood |
3M Double Coated Tape, 9500PC, 6.0 mil | Thomas Goldkamp | 37728 | |
Flexmark 90 PFW Liner | FLEXcon | FLX000620 | backing for handling of double coated tape |
Model SC Plotter (adhesive cutter) | USCutter | SC631E | used to cut adhesive in ring shapes to connect coverslips to petri dishes |
60 mm Petri Dish with 20 mm Hole | MatTek Corporation | P60-20-F-NON | |
High Intensity Illuminator (white light source) | Fiber-Lite | 4715MS-12WB10 | |
Power Meter | Newport | 1916-R | detect power at 524 nm when using white light source |
Slim Profile Wand Detector | Newport | 918D-ST | for use with power meter |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | used to make PDMS molds; refer to source 7 for methods |
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Round | synthesized in house | refer to source 7 for methods | |
Dextran, Fluorescein, 2,000,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Life Technologies | D7137 | can use alternative tagged dextrans; 2000 kDa does not diffuse readily into a 5% 3.4kDa PEGDA hydrogel |
1 mL Syringe, Luer-Lok | BD | 309628 | |
Acrodisc Syring Filter, 0.2µm Supor Membrane, Low Protein Binding | Pall | PN 4602 | |
sticky-Slide VI0.4 | Ibidi | 80601 | microfluidic devices that can be used to house hydrogels |