Capillaire Elektroforese Scheiding van monoklonaal antilichaam isovormen gebruiken een neutrale capillair
Summary
Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Abstract
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Introduction
Monoklonale antilichamen (mAbs) zijn biotherapeutic eiwitten met toenemende belangstelling als gevolg van hun vermogen om op te treden tegen verschillende chronische en degeneratieve ziekten 1. Net als andere biomoleculen, mAb's zijn gevoelig voor verschillende fysicochemische modificaties ondergaan in alle stadia van hun levenscyclus (dat wil zeggen, van biosynthese het eindproduct). Dergelijke modificaties omvatten, maar zijn niet beperkt tot: deamidatie, glycosylering, oxidatie, cyclisatie, isomerisatie, aggregatie en proteolytische splitsing 2. Vandaar, analytische technieken in staat om intrinsieke isovormen op te lossen zijn nodig om mAb's heterogeniteit en stabiliteit te monitoren om de kwaliteit specificaties vast te stellen.
Capillaire elektroforese (CE) is een krachtige scheidingstechnologie uitgevoerd outinside een smalle kwartsglas buis (um bereik) gevuld met een achtergrondelektrolyt (BGE). Bij toepassing van een elektrisch veld (tot 30.000 V), geladen molecuuls migreren naar de elektrode met tegengestelde lading (bijvoorbeeld elektro-driven scheiding). Het gebruik van hoge spanningen CE toelaat snel en analyses van doelmatigheid die hoger dan klassieke gelelektroforese zijn. Capillaire zone elektroforese (CZE) is een CE-gebaseerde techniek routinematig gebruikt in de biofarmaceutische industrie voor de kwaliteit van het product beoordelen 3-9. In tegenstelling tot andere vormen van CE (bijvoorbeeld, capillaire gelelektroforese, capillaire iso-elektrische focussering) of chromatografie gebaseerde werkwijzen kunnen CZE worden uitgevoerd zonder denatureringsmiddelen of vaste-fase-interfaces, waardoor de analyse van de inherente heterogeniteit van mAbs dichtbij hun natieve toestand 10 . CZE scheiding van mAb isovormen plaatsvindt in een gesmolten-silica capillaire bedekt met een hydrofiel polymeer (neutrale capillair) en is gebaseerd op hun verschillende elektroforetische mobiliteit die wordt geregeerd door lading, massa, grootte en vorm (of hydrodynamisch volume) 11. mAb resten gedetecteerd wanneerze gemobiliseerd en door het detectievenster, die wordt waargenomen door een ultraviolet (UV) detector bij 214 nm 4.
De succesvolle implementatie van deze analysetechniek is afhankelijk van de juiste aandacht voor details voor en tijdens het experiment. anderszins handelen zullen de kosten en tijd te verhogen om de analyse uit te voeren, wat uiteindelijk leidt tot constante mislukking en frustratie.
Hier presenteren we een stap-voor-stap handleiding voor een succesvolle analyse van mAb heterogeniteit voeren door CZE door de uitgebreide uitleg over de bereiding van oplossingen en monsters, de voorbereiding van de CE-systeem, het instrument methoden opgericht, de data-acquisitie en de verwerking. Ten behoeve van deze oefening een recombinant volledig menselijke anti-tumor necrosis factor alpha (anti-TNFa) mAb gebruikt als model eiwit; echter kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast voor de analyse van andere eiwitten gezien korte modificaties. EENdditionally, een aantal aanbevelingen om te verzachten mogelijke problemen worden voorgesteld. De lezer wordt aangemoedigd om strikt volgen van het voorgestelde protocol, als de kans om te slagen zal toenemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze tutorial, benadrukken we het belang van goede praktijken bij het uitvoeren van CZE analyses van mAb's om de kans te vergroten om te slagen. Echter, wanneer CZE wordt gebruikt op een routine-basis, problemen ontstaan onvermijdelijk 12.
Voor het beste resultaat, is het belangrijk om de noten die in het hele protocol werden opgenomen te volgen, omdat ze de analist om te overwinnen en het oplossen van moeilijke stappen zal helpen. Een belangrijke overweging om optimale res…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Materials
| Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
| ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
| (Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
| 6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
| eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
| eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
| Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
| Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
| Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
References
- Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases. Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).
- Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).
- Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis. Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).
- Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).
- He, Y., et al. Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column. Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).
- He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary. J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).
- Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics. Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).
- Štěpánová, S., Kašička, V. Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods. J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).
- Štěpánová, S., Kašička, V. Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins. Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).
- Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
- Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. Intact protein analysis in the biopharmaceutical field. J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).
- Altria, K. D., Altria, K. D. Troubleshooting. Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications. , (1996).
- Ma, S., Nashabeh, W. Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis. Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).
- Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital. Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).
