A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
Effekt av kandidat antibakteriella behandlingar måste demonstreras i djurmodeller av infektion som en del av forsknings- och utvecklingsprocessen, företrädesvis i modeller som efterliknar den avsedda kliniska indikationen. Ett förfarande för inducering av robusta lunginfektioner hos immunkompetenta råttor och möss beskrivs som möjliggör för bedömningen av behandlingar i en modell av allvarlig pneumoni orsakad av S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae eller A. baumannii. Djuren bedövas och ett agar-baserad ympen deponeras djupt in i lungorna via icke-kirurgisk intratrakeal intubering. Den resulterande infektion är konsekvent, reproducerbar och stabil under minst 48 h och upp till 96 h för de flesta isolat. Studier med salu antibakteriella har visat god korrelation mellan in vivo effektivitet och in vitro-känslighet, och samstämmighet mellan farmakokinetiska / farmakodynamiska mål bestämsi denna modell och kliniskt accepterade mål har observerats. Även om det finns en initial investering i tid när man lär sig tekniken, kan den utföras snabbt och effektivt när kunskaper uppnås. Fördelarna med modellen inkluderar eliminering av neutropeni krav ökad robusthet och reproducerbarhet, förmågan att studera flera patogener och isolat, ökad flexibilitet i studiedesign och etablering av en utmanande infektion i en immun värd.
Utvärdera effekten av potentiella läkemedelskandidater i djurmodeller av infektion är en kritisk komponent i antibakteriella läkemedelsutvecklingsprocessen. In vivo effektivitetsstudier ger viktiga data för beslutsfattandet över loppet av upptäckten insatser från klarlägga struktur-aktivitetssamband (SAR) och optimera bly kemisk serie genom att bestämma farmakokinetiska-farmakodynamiska (PK / PD) egenskaper hos föreningar och stödja dosen för klinisk utveckling och godkännande. Ett stort antal djur infektionsmodeller beskrivs i litteraturen för dessa ändamål. En av de vanligaste och mest använda modellerna är neutropeni mus lår infektion, som var uppfunnen av Eagle 1, 2 och senare utökas med Vogelman och Craig 3, 4. Denna modell har varit ovärderlig för att stödja fastställandet av bakterie brytpunkter och för att tillhandahålla PK / PD mål för att styra dosering till människa. Det finns många examenciper där det prediktiva förmåga av denna modell har visat 4-7. Men en av nackdelarna med infektionen låret modellen bristen på direkt relevans för lunginfektioner. Det finns nu en större tonvikt på att matcha infektionsstället i djurmodeller till infektionsstället i människor; och sålunda, för att studera föreningar för behandling av lunginflammation, är det idealiskt att utnyttja en lunginfektionsmodell hos djur.
Flera metoder för att inducera lunginfektioner hos försöksdjur har beskrivits och använts för antibakteriella effektivitetsstudier inklusive intranasal inhalation, aspiration via munhåla rutten aerosolexponering och kirurgisk intratrakeal ympning 8. I många fall måste djuren (särskilt möss) först göras neutropena för att uppnå en robust lunginfektion. Trots detta allvarligt tillstånd av nedsatt immunförsvar, är antalet bakteriella patogener och stammar som producerar livskraftiga infektioner hos gnagarebegränsad. Till exempel kan det vara svårt att framgångsrikt etablera Haemophilus influenzae eller Acinetobacter baumannii i lunginflammation modeller 9, 10, och ännu mer virulent patogener, såsom Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa och Klebsiella pneumoniae, kan innebära utmaningar 11-13.
1991 beskrev Smith en lunginfektionsmodell hos immunkompetenta avvanda råttor där infektion etablerades genom att ingjuta bakterier direkt in i lungorna via en enkel icke-kirurgisk intratrakeal intubering metod 14. Berry et al. senare ändrat metod för att infektera möss 15. Med hjälp av en agar-baserad inokulum, inducerar denna ympning teknik robusta lunginfektioner hos både immunkompetenta råttor och möss med S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa och A. baumannii. Det är mottaglig för ett brett spektrum av isolat, inklusive de som härbärgerar olika resistringsfaktorer och de som inte producerar en livskraftig infektion via andra ympning vägar. Den tillåter också effekten som skall fastställas i immunkompetenta djur, ett tillstånd som är mer relevant än den traditionella neutropeni musmodell för patientpopulationer som inte är allvarligt nedsatt immunförsvar. Konsistensen och tillförlitligheten i denna modell över flera patogener och isolat gör den väl lämpad för antibakteriella effektivitetsstudier.
För optimal framgång reproducera denna infektionsmodell, bör följande ytterligare förslag övervägas. Virulens hos nya isolat kan förbättras genom att passera 2 – 3 gånger in vivo före användning i en studie. Frysta bakterie bestånd bör alltid framställas från en primär in vivo-härledda källa med så få passager som möjligt från den ursprungliga, och omfrysning eller återanvändning av den upptinade lager motverkas. Använda senaste kliniska isolat som återvunnits från patienter med lunginflammation, och / eller förbereda kulturer i logfas tillväxt kan också bidra till att förbättra etableringen av infektionen. En fem-faldig utspädning i ägarn (t.ex. 2 ml saltlösningssuspension sattes till 8 ml agar) kan användas i stället för tio-faldigt för att öka den bakteriella inokulatet och inokulum volymen kan justeras baserat på storleken av djuret (t.ex. 200 | il / djur är vanligtvis inokuleras i 250 g råttor). Före tillsats av saltlösning bakteriesuspensionen in iagar (dvs. steg 2,3), kan bakterietäthet förutsägas eller uppskattas genom visuell inspektion, MacFarland standarder eller optiska densitetsmätningar. Det är bra att bekanta sig med de in vitro tillväxtegenskaper för varje isolat innan start vid in vivo experiment. Konsekvens i tillväxt och hantering möjliggör den mest noggrann uppskattning av bakterietätheten för varje givet isolat. Mikrobiologiska standardmetoder som skiljer sig från dem som beskrivs, såsom alternativa medier och vävnads homogenisatorer, kan användas som är lämpligt för framställning av inokulat och listning av bakterier från infekterade vävnader.
Det rekommenderas att förbereda eller smälta agar dagen före experimentet och förvara den natten i en separat vattenbad inställd på 50 ° C. Detta kommer att förenkla processen och att skydda mot agar är för varmt vid tidpunkten för infektion. En temperatur på 41 – 42 ° C uppnår en god balans mellan upprätthålning agar i flytande tillstånd utan att vara alltför varmt för kortsiktiga bakteriell överlevnad. Som ett möjligt alternativ till näringsagar, har ädelagar med framgång använts i vissa experiment. Ett rör agar inokulum är vanligen tillräckligt för en hel experiment (och rekommenderas), men flera rör kan förberedas för att infektera ett stort antal djur (t.ex. mer än 60) eller när den infekterande processen tar längre tid än 30-45 minuter Om multipla inokulatnivåer rören erfordras, tillsätt saltlösning bakteriesuspension till varje rör av agar som det behövs. Detta minskar risken att bakteriell överlevnad och / eller lämplighet kommer att påverkas av förlängd exponering för en förhöjd temperatur före inokulering. Det bör noteras att med hjälp av flera inokulatnivåer rör också kan kräva ytterligare djur randomisering förfaranden. När det är möjligt, infektera alla djur från samma beredning av inokulat. Det rekommenderas att anpassa storleken på experiment för att den nuvarande kompetensnivå med technique.
En skicklig vetenskapsman kan intuberas och inokulera ett djur i mindre än 30 sekunder och inokulera upp till 5 – 6 djur per sats (dvs med en spruta full av agar inokulum). För dem som lär tekniken, är hastigheten viktig som agar börjar stelna; emellertid är viktigare noggrann placering av inokulat. Börja med 1 eller 2 djur per sats, och öka allteftersom tekniken blir mer bekant. Djuren fortsätter att andas under intubation; sålunda, tidsfönstret för ympning beror på hur snabbt djuret återhämtar sig från isofluran, som bör vara ungefär 2-3 min. Djur som väcker under processen kan åter bedövas och försökte en andra gång, men det är inte rekommenderat att göra så upprepade gånger. Framgångsrik ympning på första försöket väntas i nästan 100% av djuren när kunskaper uppnås. Observera att det är lättare att lära sig tekniken med användning av råttor först; möss är mer känsliga och mindre förls är mer benägna att blockering med stelnat agar om inte manipuleras snabbt. Pre-warming sprutor, slangar och saltlösning samt att hålla den intubering anordningen på en varm (inte het) yta, såsom en värmedyna på låg inställning kan hjälpa till att förhindra stelning av ägarn. När lära tekniken, är det också användbart att öva korrekt placering av inokulum med användning av en mörk-färgad färgämne (såsom koncentrerad metylenblått) i stället för den bakteriesuspension i agar. Utföra proceduren som beskrivs, men avliva djuret omedelbart efter ympning av färgämnet (inte tillåta djuret att återhämta sig mellan anestesi och eutanasi). Dissekera att avgöra var färgämnet har placerats, och justera tekniken därefter.
Det primära effektmåttet i denna modell är CFU från infekterade lungor. Överlevnad är inte en bra indikator på bakteriell belastning och inte är en rekommenderad endpoint. För effektstudier, är den föreslagna N 5 – 6 djur per grupp eftersom det är predicted att detektera ≥1 log 10 CFU skillnader mellan grupper med minst 90% effekt. Djur kan smittas i grupper så att burkamrater förblir tillsammans, eller en sann slumpprocess kan följas. Observera att om grupper tilldelas av bur, bör grupperna vara smittade i en slumpmässig sekvens med end-of-studie tillväxtkontroller infekterade sist (för att bekräfta att bakteriell överlevnad / fitness påverkades inte av den tid utsätts för en förhöjd temperatur i vattenbadet). Inga data Censurering metoder bör vara nödvändigt, och ingen rekommenderas med undantag av omedelbart borttagande av djur som har varit uppenbarligen mis-ympade i början av studien (före initiering av eventuella behandlingar). Djur som avlivas före slutet av studien bör provtas och resultat ingår i datamängden inte ett giltigt skäl för uteslutning identifierades prospektivt (dvs. en händelse samband med infektion eller behandling). Drug överföring kan affect några prover och är en viktig faktor i alla in vivo-infektionsmodeller. Om en förening ges ofta, nära tidpunkten för eutanasi eller har en lång halveringstid, kan det vara närvarande i vävnadshomogenat vid en tillräckligt hög koncentration för att fortsätta att döda bakterier ex vivo under den bakteriella uppräkning processen (utspädning och plätering av proverna eller på agarplattorna under natten inkubation). För att förhindra detta, aktiverat kol och / eller ett tillsatsmedel som bryter ned den aktiva molekylen utan att skada bakteriecellerna kan sättas till provet före homogenisering. Andra metoder inkluderar centrifugering av prover för att avlägsna huvuddelen av den aktiva föreningen (som bör förbli i supernatanten) och med användning av olika spädning och utstrykning scheman för att tillräckligt späda den aktiva föreningen till en icke-inhiberande koncentration.
Som framgår av de exempel som visas i figur 2, denna modell framgångsrikt induces lunginfektioner hos gnagare med ett brett spektrum av organismer, inklusive dem som inte växer bra i andra modeller (t.ex. H. influenzae). Dessa infektioner är konsekventa och reproducerbara, vilket minskar sannolikheten för att försöken måste upprepas på grund av modell fel och / eller dålig prestanda med ett givet isolat. Även om djuren är immunkompetenta, de är oförmögna att snabbt lösa infektion, om alls. Detta möjliggör ökad flexibilitet i studie längd, eftersom många isolat upprätthålla en livskraftig infektion genom åtminstone 96 timmar utan behov av upprepade injektioner för att bibehålla neutropeni. Den potentiella fördelen av att studera antibakteriell effekt i immunkompetenta djur har noterats tidigare 20, 21, och det finns bevis för att för vissa föreningar (t.ex. oxazolidinoner), kan uppgifter från icke-neutropena gnagare mer exakt förutsäga mänskliga exponering mål jämfört med dem som återges neutropeni 5. Den mångsidigt verktyg för tHan modell visas i figurerna 3 och 4 och tabellerna 1 och 2. Dessa studier är en del av en stor samling av publicerade och opublicerade data som har genererats med denna modell för att stödja ledningen optimering ansträngningar 16, 17, 22-24, för jämförelse och bekräftelse av föreslagna mänsklig doseringsregimer 19, 25-29 och för PK / PD karakterisering 18, 30-32 .While denna modell är initialt mer komplicerat att genomföra jämfört med intranasal inandning metoden, det finns många fördelar som beskrivits ovan. Med övning och rutinmässig användning, bör de tekniker blir lätt att utföra.
Det kan noteras i vissa studier att bakteriebördan vid baslinjen var lägre än vad som normalt riktad i andra lunginfektionsmodeller. Detta beror till stor del på den önskade utspädningen i agar och liten utmaning volym, särskilt i möss. Det bör emellertid också noterasatt bakterietillväxt sågs i samtliga fall, även när den initiala belastningen var relativt låg. Målet baslinjen bakteriehalten är 6-6,5 log 10 CFU / lungor (6,8 till 7,3 log 10 CFU / g av vävnad hos möss baserade på genomsnittliga lungvikter) vilket motsvarar densiteter uppskattade i humana patienter med svår lunginflammation 33. En högre baslinje börda kan åstadkommas genom att ytterligare koncentrera den bakteriella inokulat eller genom att fördröja starten av föreningen administrationen att tillåta ytterligare bakterietillväxt; dock kan öka utmaningen belastningen för mycket leda till onormalt allvarlig och akut sjukdom (t.ex. död i mindre än 24 timmar) som är behandlingsresistenta mot alla antibakteriella behandlingar oavsett känslighet. Även om inokulatet är från början placeras företrädesvis i den vänstra lungan hos djuret, infektionen sprider sig i allmänhet i hela båda lungorna. Progressiv lungsjukdom, spridning av bakterier till andra organ, och slutligen sjuklighet är ofta Observed med S. pneumoniae, K. pneumoniae och P. aeruginosa. Av intresse, infektioner med H. influenzae och A. baumannii är oftast mer sluten och sällan leder till döden vid den föreskrivna bakterie inokulat.
Effekt resultaten från denna modell har korrelerade väl med in vitro-känslighet profiler samt definierade PK / PD mål. Minskningar i bakteriell belastning rutinmässigt observerats för isolat anses vara känsliga för medlet som testas, medan de som anses resistenta uppvisar ingen förändring eller bakterietillväxt över baslinjen 16, 17, 19, 24-29. Studier på råttor utvärdera två kinoloner och en makrolid enligt denna modell 32 har visat att PK / PD mål som krävs för en 1-log 10 minskning av S. pneumoniae jämfört med baseline korrelerad med målet bestäms i neutropena möss och, ännu viktigare, med kliniska mål för samhällsförvärvad bakteriell pneumOnia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, en ny mekanism antibiotikum, testades mot flera S. pneumoniae och krävde en liknande PK / PD mål för en 1-log 10 minskning av denna lunginfektionsmodell 31 som krävs för en 1-log 10 minskning av neutropeni låret modell 36 när lungpenetration har beaktats (data på fil). På liknande sätt är PK / PD-mål som bestäms i möss för GSK2251052 mot P. aeruginosa var i överensstämmelse för stasis, 1- och 2-log 10 minskningar i CFU mellan denna lungmodellen 30 och neutropena låret infektionsmodell när lungpenetration ansågs 37, 38 . Korrelation med en neutropeni lunginfektion modell med intranasal ympning var dålig; Men GSK2251052 inte producera mer än en statisk reaktion i den studien 38. Detta kan tillskrivas den högre bakteriell inokulum, vilket var 8 log 10 CFU / mus jämfört med sex log <sub> 10 CFU / mus i neutropeni låret 37 och intratrakeal intubering 30 modeller. Insamling av data som är avgörande för benchmarking, eftersom det tillåter direkt jämförelse med befintliga modeller och korrelation med kliniska data för att bedöma translationell förutsägelseförmåga. Mer utbredd användning av intratrakeal intubering lunginfektionsmodell kommer att ge ytterligare uppgifter för dessa typer av analyser.
Det finns flera begränsningar av denna immunlunginflammation modell. Först är det inte väl lämpad för att utvärdera utvecklingen av spontan motstånd eftersom den höga bakterie inokulum krävs i allmänhet för sådana studier resulterar i alltför svår infektion. Efter försök att uppnå bakteriella bördor 7 eller 8 log 10 CFU vid baslinjen, snabb sjuklighet har observerats (dvs. djur blir döende på mindre än 24 timmar) trots noggrann tvättning av inokulat för att avlägsna redan existerande toxiner (uppgifter om fil). Detkan vara möjligt att övervinna det här problemet genom att använda större gnagare. Råttor, särskilt tyngre råttor (> 250 g), verkar bättre tolerera högre inokulat jämfört med möss och kan vara lämpliga för dessa typer av studier. En andra begränsning är att användningen av agar som en infektion-förstärkare kan hindra att använda modellen för utvärdering av vissa värd: patogen interaktioner. Man tror att ägarn ger en skyddad brännpunkt tills infektionen är fullt etablerad i lungan. Det är möjligt att leverera ympen i saltlösning snarare än agar att lösa det här problemet, Det bör dock noteras att detta endast kommer att producera infektion med några isolat. För det tredje finns det en brant inlärningskurva krävs för att bli skicklig i tekniken. Proceduren kan vara känslig, i synnerhet i möss. Det är lätt att av misstag placera metallkanyl in i matstrupen, och överdriven kraft kan leda till punktering av antingen matstrupen eller luftstrupen. Noggrann placering av inokulatet är ocksåkrävs eller djur kan antingen inte återhämta sig eller inte i tillräcklig utsträckning smittade. Men med tålamod och uthållighet, kan man bli mycket skicklig och utföra tekniken snabbt, smidigt och exakt.
Genom att ta bort kravet på neutropeni, ökar robusthet och reproducerbarhet, vilket gör att utredarna att studera flera patogener och isolat, förbättra flexibiliteten i experimentell design och ger en utmanande infektion för att karakterisera farmakodynamik för lunginflammation, tillägger denna immunlunginfektionsmodell betydande värde antibiotikumet upptäckten gemenskap. Ökad användning av denna modell med ytterligare utredare kommer att bidra till att ge den nödvändiga benchmarking för att få mer utbredd acceptans och fortsätta att ge stöd information lämplig tolkning.
The authors have nothing to disclose.
JH vill erkänna och tacka mentor, vän och tidigare chef Valerie Berry för först lära oss denna modell; och Gary Woodnutt, som lärde oss grunderna för och inspirerat vårt engagemang för området antibakteriella PK / PD. Alla författare vill tacka David Payne för hans stöd och uppskattning för vår vetenskap. Vi vill tacka för vår tidigare in vivo mikrobiologi kolleger som har bidragit till den mängd data som genereras med hjälp av dessa metoder, särskilt Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Page och Nerissa Simon. Slutligen, vårt tack till våra in vitro mikrobiologi kolleger för deras hjälp, särskilt för att tillhandahålla alla MIC vi begär (Lynn McCloskey, Josh West och Sharon min); och för vår klinisk mikrobiologi team som ger expertråd och stöd (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman och Deborah Butler).
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |