A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
Effekt av kandidat antibakteriell behandling må demonstreres i dyremodeller med infeksjon som en del av oppdagelsen og utviklingen prosess, fortrinnsvis i modeller som etterligner den tiltenkte kliniske indikasjon. En fremgangsmåte for å indusere robuste lungeinfeksjoner hos immunkompetente rotter og mus er beskrevet som gjør det mulig for vurdering av behandlinger i en modell for alvorlig lungebetennelse forårsaket av S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae eller A. baumannii. Dyrene ble bedøvet, og en agar-baserte inokulum avsettes dypt i lungene via ikke-kirurgisk intratrakeal intubering. Den resulterende infeksjon er konsekvent, reproduserbar og stabil i minst 48 timer og opp til 96 timer for de fleste isolater. Studier med markeds antibakterielle midler har vist god korrelasjon mellom in vivo effekt og in vitro-følsomhet, og samsvar mellom farmakokinetiske / farmakodynamiske mål bestemmesi denne modellen og klinisk aksepterte mål har blitt observert. Selv om det er en innledende tid investering når lære teknikken, kan den bli utført hurtig og effektivt når dyktighet er oppnådd. Fordeler med modellen inkluderer eliminering av nøytropeni kravet, økt robusthet og reproduserbarhet, evne til å studere flere patogener og isolerer, økt fleksibilitet i studiedesign og etablering av en utfordrende infeksjon i en immunkompetente vert.
Evaluere effekten av potensielle legemiddelkandidater i dyremodeller av infeksjon er en kritisk komponent i den antibakterielle stoffet funnet prosessen. In vivo effektstudier gi viktige data for beslutnings over span av funn innsats fra belyse struktur-aktivitetsforhold (SAR) og optimalisere leder kjemiske serien gjennom å bestemme farmakokinetisk-farmakodynamiske (PK / PD) karakteristikk av forbindelser og støtte utvalg dose for klinisk utvikling og myndighetsgodkjennelse. Tallrike dyr infeksjonsmodeller er beskrevet i litteraturen for disse formål. En av de vanligste og mest brukte modellene er nøytropeni musen lår infeksjon, som ble utviklet av Eagle 1, 2 og senere utvidet med Vogelman og Craig tre, fire. Denne modellen har vært uvurderlig for å støtte fastsettelse av bakterielle følsomhetsbrytningspunkter og for å gi PK / PD mål å veilede menneske dosering. Det er mange eksamensipper hvor den prediktive evnen til denne modellen har vist seg 4-7. Imidlertid er en av ulempene med låret infeksjonsmodell er mangelen på direkte relevans til lungeinfeksjoner. Det er nå en større vekt på matchende stedet for infeksjon i dyremodeller til området for infeksjon hos mennesker; og således, for å studere forbindelsene for behandling av lungebetennelse, er det ideelt å anvende en lungeinfeksjon modell i dyr.
Flere metoder for å indusere lungeinfeksjoner i forsøksdyr har blitt beskrevet og benyttet for antibakterielle effektstudier inkludert intranasal innånding, aspirasjon via orofaryngeal rute, aerosol eksponering, og kirurgisk intratrakeal inokulasjon åtte. I mange tilfeller må de dyr (særlig mus) først bli gjengitt nøytropeni for å oppnå en robust lungeinfeksjon. Til tross for dette alvorlig immunsvikt tilstand, er antall bakterielle patogener og stammer som produserer levedyktige infeksjoner hos gnagerebegrenset. For eksempel kan det være vanskelig å kunne etablere Haemophilus influenzae eller Acinetobacter baumannii i pneumoni modeller 9, 10, og enda mer virulente patogener, slik som Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella pneumoniae, kan by på utfordringer 11-13.
I 1991, Smith beskrev en lungeinfeksjon modell i immunkompetente weanling rotter der infeksjon ble etablert av instilling bakterier direkte inn i lungene via en enkel nonsurgical intratrakeal intubasjon metode 14. Berry et al. senere modifisert metode for å infisere mus 15. Ved hjelp av en agar-baserte podestoff, induserer denne vaksinen teknikken robuste lungeinfeksjoner i både immun rotter og mus med S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa og A. baumannii. Det er mottagelig for et bredt spekter av isolater, inkludert de husing forskjellige motståkrings determinanter og de som ikke produserer en levedyktig smitte via andre inokulasjon ruter. Det gir også effekt skal fastsettes i immunkompetente dyr, en tilstand som er mer relevant enn den tradisjonelle nøytropeni musemodell for pasientgrupper som ikke er alvorlig immunsvikt. Konsistensen og pålitelighet av denne modellen på tvers av flere patogener og isolater gjør det godt egnet for antibakterielle effektstudier.
For optimal suksess i å reprodusere denne infeksjonen modellen, bør følgende tilleggsforslag vurderes. Virulens av nye isolater kan bli styrket ved aging 2 – 3 ganger i vivo før utnyttelse i en studie. Frosne bakterielle bestander bør alltid være forberedt fra en primær in vivo avledede kilde med så få passasjer som mulig fra den opprinnelige, og refreezing eller gjenbruk av tint lager frarådes. Ved hjelp av nyere kliniske isolater utvinnes fra pasienter med lungebetennelse, og / eller utarbeidelse kulturer i log fase vekst kan også bidra til å forbedre etablering av infeksjonen. En fem-gangers fortynning inn i agaren (for eksempel 2 ml saltsuspensjon tilsatt til 8 ml agar) kan brukes i stedet for ti-ganger for å øke bakteriepodestoff, og inokulumet volumet kan justeres basert på størrelsen på dyret (f.eks 200 pl / dyr vanligvis er inokulert i 250 grams rotter). Før tilsetting av saltvann bakteriesuspensjonen inn i detagar (dvs. trinn 2.3), bakterietettheten kan forutsies eller estimeres ved visuell inspeksjon, MacFarland standarder eller målinger optisk tetthet. Det er nyttig å bli kjent med in vitro vekst egenskaper for hvert isolat før drive in vivo eksperimenter. Konsistens i vekst og håndtering muliggjør den mest nøyaktige estimering av bakterietettheten for en gitt isolat. Standard mikrobiologiske metoder som er forskjellige fra de som er beskrevet, for eksempel alternative media og vev homogenisatorer, kan anvendes som passende for fremstilling av podestoffer og opplisting bakterier fra infiserte vev.
Det er sterkt anbefalt å forberede eller smelte agar dagen før forsøket og lagre det over natten i en egen vannbad innstilt på 50 ° C. Dette vil forenkle prosessen og å beskytte mot agaren blir for varm på tidspunktet for infeksjon. En temperatur av 41 – 42 ° C oppnår en god balanse mellom maintaining agar i flytende tilstand uten å være for varmt for kortsiktig bakteriell overlevelse. Som et mulig alternativ til næringsagar, og edel agar blitt brukt i noen eksperimenter. Et rør av agar-inokulum er vanligvis tilstrekkelig for en hel eksperiment (og anbefales), men multiple rør kan fremstilles for å infisere et stort antall dyr (for eksempel mer enn 60), eller når det infiserer prosessen tar lengre tid enn 30 – 45 min Hvis multiple inokulum rør er nødvendig, tilsett salt bakteriell suspensjon til hvert rør av agar som det er nødvendig. Dette reduserer risikoen for at bakteriell overlevelse og / eller egnethet vil bli påvirket av forlenget eksponering til en forhøyet temperatur før inokulering. Det skal bemerkes at ved hjelp av flere podestoff Rørene kan også kreve ytterligere dyr randomisering prosedyrer. Når det er mulig, infisere alle dyr fra samme podestoff forberedelse. Det anbefales å skreddersy størrelsen eksperimenter til dagens nivå av dyktighet med technique.
En dyktig forsker kan intubere og inokulere et dyr i løpet av mindre enn 30 s og inokuler opp til 5 – 6 dyr pr batch (dvs. med en sprøyte full av agar inokulum). For de som lærer teknikken, er fart viktig som agar vil begynne å stivne; imidlertid, er nøyaktig plassering av inokulumet viktigere. Begynn med 1 eller 2 dyr per batch, og øke etter hvert som teknikken blir mer kjent. Dyrene fortsette å puste under intubasjon; således, at tidsvinduet for inokulering avhenger av hvor raskt dyret gjenvinner fra isofluran, som bør være omtrent 2 – 3 min. Dyr som vekker under prosessen kan gjen bedøvet og forsøkt en gang, men det er ikke anbefalt å gjøre det flere ganger. Vellykket inokulering på den første forsøk er ventet i nesten 100% av dyrene når dyktighet er oppnådd. Merk at det er lettere å lære teknikk med rotter først; mus er mer delikat og den mindre forls er mer utsatt for blokkering med størknet agar hvis ikke manipulert raskt. Pre-oppvarming sprøyter, tubing og saltvann samt holde intubasjon enhet på en varm (ikke varmt) overflate, for eksempel en varmepute på lav innstilling, kan bidra til å forhindre størkning av agar. Når lære teknikken, er det også nyttig å praktisere riktig plassering av inokulumet ved hjelp av en mørkfarget fargestoff (slik som konsentrert metylenblått) i stedet for den bakterielle suspensjon i agar. Utfør prosedyren som er beskrevet, men avlive dyret umiddelbart etter inokulering av fargestoffet (ikke tillater dyret å komme seg mellom anestesi og eutanasi). Dissekere å bestemme hvor fargestoffet er plassert, og justere teknikken tilsvarende.
Det primære endepunktet i denne modellen er CFU fra infiserte lunger. Overlevelse er ikke en god indikator på bakteriell belastning og er ikke en anbefalt endepunkt. For effektstudier, er det foreslått N 5 – 6 dyr per gruppe som dette er predicted for å oppdage ≥1 log10 CFU forskjeller mellom gruppene med minst 90% strøm. Dyr kan bli smittet i grupper slik at buret mates forbli sammen, eller en sann randomisering fremgangsmåte kan følges. Merk at dersom grupper er tildelt av bur, bør gruppene være infisert i en tilfeldig sekvens med ende-til-studie vekstkontroll infiserte siste (for å bekrefte at bakteriell overlevelse / form ble ikke påvirket av hvor lang tid utsettes for en forhøyet temperatur i vannbad). Ingen data Sensur av metoder skulle være nødvendig, og ingen er anbefalt med unntak av umiddelbar fjerning av alle slags dyr som har vært åpenbart mis-inokulert ved begynnelsen av studien (før oppstart av noen behandlinger). Dyr som avlives før slutten av studien bør tas prøver og resultater inngår i datasettet med mindre en gyldig grunn for utelukkelse ble identifisert prospektivt (dvs. en hendelse relatert til infeksjon eller behandling). Drug carry kan affect noen prøver og er en viktig faktor i alle in vivo smittemodeller. Dersom en forbindelse er gitt ofte, nær tidspunktet for eutanasi eller har en lang halveringstid, kan det være til stede i vev homogenat ved en tilstrekkelig høy konsentrasjon til å fortsette å drepe bakterier ex vivo i løpet av bakteriell telling prosess (fortynning og plettering av prøvene eller på agar plater i løpet av natten inkubasjon). For å forhindre dette, aktivt kull og / eller et additiv som forringer det aktive molekylet uten å skade bakteriecellene kan tilsettes til prøven før homogenisering. Andre fremgangsmåter inkluderer sentrifugering av prøvene for å fjerne det meste av den aktive forbindelse (som bør forbli i supernatanten) og anvende forskjellig fortynning og plette ordninger for å i tilstrekkelig grad å fortynne den aktive forbindelse til en ikke-inhibitorisk konsentrasjon.
Som vist ved de eksemplene som er vist i figur 2, denne modellen med hell induces lungeinfeksjoner hos gnagere med et bredt spekter av organismer, inkludert de som ikke vokser godt i andre modeller (f.eks H. influenzae). Disse infeksjonene er konsistente og reproduserbare, noe som reduserer sannsynligheten for at eksperimenter må bli gjentatt på grunn av modellfeil og / eller dårlig ytelse med en gitt isolat. Selv om dyrene er immunkompetente, er de ikke i stand til raskt å løse infeksjon, hvis i det hele tatt. Dette sørger for økt fleksibilitet i studie lengde, som mange isolater opprettholde et levedyktig smitte gjennom minst 96 timer uten behov for gjentatte injeksjoner for å opprett neutropeni. Den potensielle nytten av å studere antibakteriell effekt hos immunkompetente dyr har blitt nevnt tidligere 20, 21, og det er dokumentert at for noen forbindelser (f.eks oksazolidinoner), data fra ikke-nøytropene gnagere kan mer nøyaktig forutsi humane eksponerings mål sammenlignet med dem gjengitt nøytropeni 5. Den multi-purpose nytten av than-modellen er vist i figurene 3 og 4 og tabell 1 og 2. Disse studiene er en del av en stor samling av publiserte og upubliserte data som har blitt generert med denne modellen for å understøtte ledningen optimalisering innsats 16, 17, 22-24, for sammenligning og bekreftelse av slått human doseringsregimer 19, 25-29 og for PK / PD-karakterisering 18, 30-32 .Mens denne modellen er i utgangspunktet mer komplisert å utføre i forhold til intranasal inhalering fremgangsmåten, er det mange fordeler som er beskrevet ovenfor. Med praksis og rutinemessig anvendelse, bør de teknikker som blir lett å utføre.
Det kan bemerkes i noen studier at den bakterielle belastningen ved start var lavere enn den som vanligvis rettet i andre lunge-infeksjonsmodeller. Dette skyldes i stor grad til den nødvendige fortynning i agar og det lille volum utfordring, spesielt i mus. Det bør imidlertid også bemerkesat bakterievekst ble sett i alle tilfeller, selv når den innledende byrden var relativt lav. Målet baseline bakteriemengde er 6 til 6,5 log 10 CFU / lungene (6,8 til 7,3 log 10 CFU / g vev hos mus basert på gjennomsnittlig lunge vekter) som tilsvarer tettheter estimerte hos mennesker med alvorlig lungebetennelse 33. En høyere referansebelastning kan bli oppnådd ved ytterligere konsentrering av bakteriepodestoff eller ved å forsinke starten av forbindelsen administrering for å tillate ytterligere bakterievekst; En økning av belastningen utfordring for mye kan føre til unormalt alvorlig og akutt sykdom (dvs. død i løpet av mindre enn 24 timer) som er motstandsdyktige overfor alle antibakteriell behandling uavhengig av følsomhet. Selv om inokulumet er i utgangspunktet plasseres fortrinnsvis i den venstre lungen av dyret, infeksjonen sprer seg vanligvis gjennom begge lunger. Progressive lungesykdom, spredning av bakterier til andre organer, og eventuelt sykelighet er ofte Observed med S. pneumoniae, K. pneumoniae og P. aeruginosa. Av interesse, infeksjoner med H. influenzae og A. baumannii er vanligvis mer inneholdt og sjelden føre til døden på foreskrevet bakteriell inocula.
Effekt resultatene fra denne modellen har korrelert godt med in vitro-følsomhet profiler samt definerte PK / PD mål. Reduksjoner i bakteriebelastning blir rutinemessig observeres for isolater anses å være følsomme for det middel som skal testes, mens de som anses motstandsdyktig oppviser ingen endring eller bakterievekst over basislinjen 16, 17, 19, 24-29. Studier i rotter som evaluerte to kinoloner og et makrolid ved hjelp av denne modellen 32 har vist at PK / PD-target nødvendig for en ett-log 10 reduksjon i S. pneumoniae, sammenlignet med referanse korrelert med målet bestemmes nøytropeni mus og, enda viktigere, med kliniske mål for samfunnet ervervet bakteriell pneumatiskonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, en ny mekanisme antibiotikum, ble testet mot flere S. pneumoniae og krevde en lignende PK / PD mål for en 1-log reduksjon 10 i denne lunge-infeksjonsmodell 31 som den som er nødvendig for en ett-log 10 reduksjon i nøytropeni lår modellen 36 når lunge penetrasjon ble tatt i betraktning (data på fil). Tilsvarende PK / PD målene fastsatt i mus for GSK2251052 mot P. aeruginosa var konsistente for stasis, 1- og 2-log 10 reduksjon i CFU mellom denne lunge modell 30 og nøytropeni lår infeksjonsmodell når lunge penetrasjon ble ansett 37, 38 . Sammenheng med nøytropeni lungeinfeksjon modell ved hjelp av intranasal vaksinasjon var dårlig; imidlertid, GSK2251052 produserte ikke mer enn en statisk respons i denne studien 38. Dette kan skyldes høyere bakteriepodestoff, som var åtte log 10 CFU / mus sammenlignet med 6 log <sub> 10 CFU / mus i nøytropeni låret 37 og intratrakeal intubasjon 30 modeller. Innsamling av data som dette er viktig for benchmarking, som gjør det mulig direkte sammenligning med eksisterende modeller og sammenheng med kliniske data for å vurdere translasjonell prediktiv evne. Mer utstrakt bruk av intratrakeal intubasjon lungeinfeksjon modellen vil gi ytterligere data for denne typen analyser.
Det er flere begrensninger av denne immunocompetent lungebetennelse modell. Først, det er ikke godt egnet til å vurdere framveksten av spontan motstand fordi den høye bakteriepodestoff vanligvis kreves for slike studier resulterer i altfor alvorlig infeksjon. Etter forsøk på å oppnå bakterie byrdene av 7 eller 8 log 10 CFU ved baseline, rask sykelighet har blitt observert (dvs. dyr blir døende på mindre enn 24 timer) til tross for grundig vask av podestoffer for å fjerne pre-eksisterende toksiner (data på fil). Denkan være mulig å løse dette problemet ved å bruke større gnagere. Rotter, spesielt tyngre rotter (> 250 g), ser ut til å bedre tåle høyere inokula sammenlignet med mus og kan være egnet for disse typer studier. En annen begrensning er at bruken av agar som en infeksjon-forsterker kan være til hinder ved bruk av modell for evaluering av visse verts: patogen interaksjoner. Det antas at agaren gir et beskyttet midtpunkt inntil infeksjonen er fullt etablert i lungene. Det er mulig å levere den inokulum i saltoppløsning i stedet for agar for å bidra til å overvinne dette problemet; Det bør imidlertid bemerkes at dette bare vil produsere infeksjon med noen isolater. For det tredje er det en bratt læringskurve som kreves for å bli dyktigere i teknikken. Prosedyren kan være delikat, spesielt i mus. Det er lett å plassere feilaktig metallet kanylen inn i spiserøret, og overdreven kraft kan føre til punktering av enten spiserøret eller trakea. Forsiktig plassering av inokulumet er ogsåpåkrevd eller dyr kan enten ikke gjenopprette eller ikke være tilstrekkelig smittet. Men med tålmodighet og utholdenhet, kan man bli svært dyktig og utføre teknikken raskt, jevnt og nøyaktig.
Ved å fjerne kravet til nøytropeni, økt robusthet og reproduserbarhet, slik at etterforskerne å studere flere patogener og isolater, forbedre fleksibiliteten i eksperimentell design og gir en utfordrende infeksjon å karakter farmakodynamikk for lungebetennelse, legger dette immunocompetent lungeinfeksjon modellen betydelig verdi mot antibiotika oppdagelsen samfunnet. Økt bruk av denne modellen ved flere etterforskere vil bidra til å gi den nødvendige benchmarking for å få mer utbredt aksept og fortsette å gi støttende informasjon for riktig tolkning.
The authors have nothing to disclose.
JH ønsker å erkjenne og takke mentor, venn og tidligere manager Valerie Berry for første lærer oss denne modellen; og Gary Woodnutt, som lærte oss grunnlaget for og inspirert vår forpliktelse til feltet av antibakterielle PK / PD. Alle forfatterne ønsker å takke David Payne for sin støtte og forståelse for vår vitenskap. Vi ønsker å takke våre tidligere in vivo mikrobiologi kolleger som har bidratt til kroppen av data generert ved hjelp av disse metodene, spesielt Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni Page og Nerissa Simon. Til slutt, vår takk går til våre in vitro mikrobiologi kolleger for deres hjelp, spesielt for å gi alle MIC vi ber om (Lynn McCloskey, Josh West og Sharon min); og for vår kliniske mikrobiologi team som gir råd og støtte ekspert (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman og Deborah Butler).
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |