A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.
候補抗菌治療の有効性は、好ましくは、意図される臨床徴候を模倣したモデルで、発見と開発プロセスの一環として、感染の動物モデルで実証されなければなりません。免疫応答性ラットとマウスで堅牢な肺感染症を誘導するための方法は、 肺炎球菌 、 インフルエンザ菌 、 緑膿菌 、 肺炎桿菌 またはA.バウマニに起因する重篤な肺炎のモデルにおける治療の評価が可能になるが記載されています。動物は麻酔し、寒天ベースの接種物は、非外科的気管内挿管を介して肺に深く堆積されます。その結果、感染は、少なくとも48時間、ほとんどの分離株の場合は最大96時間のために、一貫性のある再現可能、かつ安定しています。販売抗菌剤を用いた研究は、 インビボでの有効性との間およびin vitroの感受性に良好な相関を示しており、薬物動態/薬力学的ターゲット間の一致が決定しますこのモデルにおいて、臨床的に受け入れターゲットが観察されています。技術の学習の初期時間の投資はあるが能力が達成されると、それは、迅速かつ効率的に行うことができます。モデルの利点は、好中球減少要件の排除、増加した堅牢性と再現性、より多くの病原体と分離し、免疫適格宿主における研究デザインと挑戦的な感染の確立で改善された柔軟性を研究する能力が含まれます。
感染の動物モデルにおける潜在的な薬物候補の有効性を評価する抗菌薬の発見プロセスの重要な要素です。 インビボでの効力研究では構造活性相関(SAR)を解明し、化合物の薬物動態・薬力学(PK / PD)特性を決定し、ための用量の選択を支援する介してリード化学シリーズを最適化することから、意思決定の発見の努力のスパン全体のための重要なデータを提供臨床開発および規制当局の承認。多数の動物感染モデルは、これらの目的のために文献に記載されています。最も一般的で広く使用されているモデルの一つはイーグル1、2によって開拓され、後にVogelmanとクレイグ3、4によって拡大された好中球減少マウス大腿感染症、です。このモデルは、細菌の感受性ブレークポイントの決意を支持するため、およびヒトの投与を導くためにPK / PDの標的を提供するための非常に貴重でした。多くの試験があります。このモデルの予測能力が4-7証明されていples。しかし、大腿感染モデルの欠点の一つは、肺感染症の直接の関連性の欠如です。ヒトでの感染部位に動物モデルでの感染部位に一致を重視が用意されました。したがって、肺炎の治療のための化合物を研究するために、動物における肺感染モデルを利用することが理想的です。
実験動物における肺感染症を誘導するためのいくつかの方法が記載され、鼻腔内、吸入、口腔咽頭経路を介して吸引、エアロゾル曝露、および外科的気管内接種8を含む抗菌有効性試験のために使用されています。多くの場合、動物(特にマウス)第堅牢な肺感染を達成するために、好中球減少レンダリングされなければなりません。この深刻な免疫不全の状態にもかかわらず、げっ歯類で実行可能な感染症を生み出す細菌病原体および株の数であります限られました。例えば、課題11-13を提起することができ、正常肺炎モデル9、10、及び例えば肺炎連鎖球菌、緑膿菌及び肺炎桿菌などのさらに多くの毒性病原体にインフルエンザ菌またはアシネトバクターバウマンニを確立することは困難です。
1991年、スミスは感染が簡単な非外科的気管内挿管法14を介して肺に直接細菌を浸透させることによって確立された免疫応答性離乳ラットにおける肺感染モデルを説明しました。ベリーら 。後にマウス15を感染させるための方法を変更しました。寒天ベースの接種物を使用して、この接種技術は、肺炎球菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、緑膿菌 とA.バウマニで両方の免疫応答性ラットとマウスで堅牢な肺感染症を誘発します。これは、様々なレジストを保有するものを含む分離株の広い範囲に適していますンスの決定および他の接種経路を介して生存可能な感染症を生じないもの。また、重度の免疫不全のではない患者集団のための伝統的な好中球減少マウスモデルよりも適切である条件、有効性は免疫応答性動物で決定することができます。複数の病原体および分離株全体でこのモデルの整合性と信頼性は、それが抗菌効力研究のために、よく最適です。
この感染モデルを再生する際に最適な成功のために、次の追加の提案を検討する必要があります。先行研究に利用し、in vivoで 3回-新たな分離株の病原性は、2を継代することによって高めることができます。凍結した細菌株は常に元からできるだけ少ない通路を有する一次in vivoの由来源から調製し、そして再凍結や解凍した株式の再利用は推奨されるべきです。最近の臨床分離株を使用して肺炎を有する患者から回収し、及び/又は対数増殖期に培養物を調製することも、感染の確立を改善するのに役立つことができます。寒天中に5倍希釈( 例えば、2 mLの生理食塩水懸濁液を8 mLの寒天に添加)は、細菌接種材料を増やす代わりに10倍を用いることができ、接種量は、動物( 例えば、サイズに基づいて調整することができます200μL/動物は通常)250グラムのラットに接種します。生理食塩水細菌懸濁液を添加する前に寒天( すなわち、ステップ2.3において)、細菌密度を予測または目視検査、マクファーランド標準または光学密度測定によって推定することができます。それぞれがインビボ実験で行う前隔離するためのin vitro増殖特性に精通すると便利です。成長と取り扱いに一貫性は、任意の分離株のための細菌密度の最も正確な推定を可能にします。このような媒体および組織ホモジナイザー代替として、記載されたものと異なる標準微生物学的方法は、接種材料を調製し、感染した組織からの細菌を列挙するために適切に使用することができます。
非常に準備したり、実験の前日に寒天溶融し、50℃に設定し、別個の水浴中で一晩、それを保存することをお勧めします。これは、プロセスを簡素化し、寒天が、感染時の熱すぎるされるのを防ぐのに役立ちます。 41の温度 – 42°Cはmaintai間の良好なバランスを実現します寧短期細菌の生存のための熱すぎるされることなく液体状態の寒天。栄養寒天の可能な代替として、希寒天正常いくつかの実験で使用されています。寒天接種材料の一つのチューブは、全体の実験のために通常は十分です(と推奨されています)が、複数のチューブは、多数の動物を感染させるために調製することができる( 例えば 60以上)または感染プロセスが長く30以上かかる時- 45分の場合複数の接種材料チューブは、それが必要とされる寒天の各チューブに生理食塩水細菌懸濁液を追加し、必要とされます。これは、細菌の生存および/またはフィットネスは、接種前に高温に長時間曝露によって影響されるというリスクを低減します。複数の接種材料の管を使用して、追加の動物の無作為化手順を必要とし得ることに留意すべきです。可能な限り、同じ接種材料の準備からすべての動物に感染します。 TEで習熟の現在のレベルに実験のサイズを調整することをお勧めしますchnique。
( すなわち寒天接種物の完全な1シリンジで)バッチ当たり6匹の動物-熟練した科学者は挿管と接種動物を30秒未満にし、5まで接種することができます。技術を学ぶ人のために、速度は寒天が固化し始めるように重要です。しかし、接種物の正確な配置がより重要です。バッチ当たり1または2の動物で始まり、そして技術がより身近になるにつれて増加します。動物は挿管時に呼吸を続けます。 3分 – したがって、接種のための時間ウィンドウは、動物が約2であるべきイソフルラン、から回復どのように迅速に依存します。処理中に目覚めた動物は再度麻酔し、二度目を試みたが、それを繰り返しそうすることは推奨されていないことができます。習熟度が達成された後の最初の試みで成功接種は、動物のほぼ100%で期待されています。最初のラットを用いた技術を習得することが容易であることに注意してください。マウスは、あまりにも、より繊細で小さくなっていますすぐに操作されていない場合はlsが固化した寒天との遮断になりやすいです。前温暖化シリンジ、チューブや生理食塩水だけでなく、このような低設定に加熱パッドとして、暖かい(熱くない)表面に挿管器具を維持するとして、寒天の凝固を防ぐことができます。技術を学ぶとき、暗い色の染料(例えば、濃縮メチレンブルーなど)の代わりに寒天で細菌懸濁液を使用して接種物の適切な配置を実施することも有用です。説明された手順を実行しますが、(動物が麻酔と安楽死の間で回復することができない)染料の接種直後に動物を安楽死させます。色素が置かれている場所を特定し、それに応じて技術を調整するために解剖。
このモデルでの主要評価項目は、感染した肺からCFUです。サバイバルは、細菌負荷の良好な指標ではありませんし、推奨エンドポイントではありません。これはpredicteであるように、グループあたり6匹の動物 – 有効性研究のために、提案したNは5であります少なくとも90%の力で群間≥1対数10 CFUの差を検出するために、D。動物はケージの仲間が一緒のままで、または真のランダム化プロセスに従うことができるように、グループに感染させることができます。細菌の生存/フィットネスが高温にさらされた時間の長さによって影響を受けなかったことを確認する(グループはケージによって割り当てられている場合、グループは最後の感染エンド・オブ・研究成長コントロールとランダムシーケンスに感染しなければならないことに注意してください水浴中で)。メソッドを検閲なしのデータが必要ではないはず、と何も明らかに(前の任意の治療の開始に)研究の開始時に誤接種された任意の動物の即時撤去を除いて推奨されていません。試験前の最後に安楽死させた動物は、サンプリングされるべきであり、排除のための正当な理由は、( すなわち、感染または治療とは無関係のイベント)プロスペクティブに同定された場合を除き、結果はデータセットに含まれます。薬物キャリーオーバーかもしれAFF電気ショック療法いくつかのサンプルおよびすべてのin vivo感染モデル全体で重要な考慮事項です。化合物は、安楽死の際に頻繁に近い所定のまたは長い半減期を有している場合、それは、(細菌の列挙プロセスの間、細菌エクスビボを殺す希釈めっき続けるに十分に高い濃度で組織ホモジネート中に存在することができますサンプルまたは一晩のインキュベーション中に寒天プレート上)。これを防止するために、活性炭および/または細菌細胞を傷つけることなく活性分子を劣化させる添加剤は、従来の均質化サンプルに添加することができます。他の方法は、(上清中に残るべき)活性化合物の大部分を除去するために、サンプルを遠心分離し、十分に非阻害濃度に活性化合物を希釈するために、異なる希釈およびメッキ方式を採用するなどがあります。
私はこのモデルが成功し、 図2に示す例により証明されるように他のモデル( 例えば、インフルエンザ菌 )でよく成長しないものを含む広範囲の生物とげっ歯類の肺感染をnduces。これらの感染症は、実験が原因でモデルの故障および/または所定の分離株とのパフォーマンスの低下に繰り返される必要があります可能性を減少させる、一貫して再現性があります。動物が免疫応答性であるが、すべてであれば、彼らは、急速に感染を解決することはできません。多くの分離株は、好中球減少症を維持するために、反復注射を必要とせずに、少なくとも96時間を介して実行可能な感染症を維持するように、これは、研究の長さが増加し、柔軟性を可能にします。免疫適格動物における抗菌効力を研究する潜在的な利点は、以前に21を20指摘されている、といくつかの化合物( 例えばオキサゾリジノン)のために、非好中球減少げっ歯類からのデータをより正確に、これらのレンダリングされた好中球減少と比較して、ヒトの暴露目標を予測することができる、という証拠があります5。トンの多目的ユーティリティ彼モデルが比較のために、これらの研究は、リード最適化の努力16を支持するために、このモデルを用いて生成された公開され、未発表データの大規模なコレクションの一部、17、22-24であり、図3及び図4および表1および2に示されていますそして、提案した人間の投与は、19のレジメン25-29およびPK / PDの特徴付け18用の確認、30-32 .Whileこのモデルは、鼻腔内吸入方法に比べて実施するために、最初はより複雑である前述したように、多くの利点があります。練習と日常的な使用では、技術が実行するのは簡単になるはずです。
これは、ベースラインでの細菌量は、通常、他の肺感染モデルにおいて標的と比べて低かったいくつかの研究に注目することができます。これは、特にマウスでは、寒天に必要な希釈および小挑戦ボリュームに大部分が原因です。しかし、それにも留意すべきですその細菌の増殖は、最初の負荷が比較的低くても、全ての場合に見られました。ターゲットベースライン細菌負荷は、重症肺炎33でヒト患者において推定密度に相当する6 6.5ログ10 CFU /肺(平均肺重みに基づいて、マウスにおける組織の6.8〜7.3対数10 CFU / g)です。より高いベースラインの負荷はさらに細菌の接種材料を濃縮することにより、または追加の細菌の増殖を可能にするために、化合物投与の開始を遅らせることによって達成することができます。しかし、あまりにも多くの課題の負荷を増大させることに関係なく、感受性のすべての抗菌治療に不応性である異常に重度の急性疾患(24時間未満で、すなわち死)につながることができます。接種材料が最初に動物の左肺に優先的に配置されているが、感染は一般的に両方の肺全体に広がります。プログレッシブ肺疾患、他の臓器への細菌の普及、および最終的な罹患率は、多くの場合、observです肺炎球菌、肺炎桿菌および緑膿菌とエド。興味深いのは、 インフルエンザ 及びA.バウマニによる感染症は通常、より含まれていると稀に所定の細菌接種物で死に至るません。
このモデルから得られた有効性の結果は、in vitroの感受性プロファイルと同様に定義されたPK / PDターゲットとよく相関しています。細菌負荷の減少は日常的に、試験される薬剤の影響を受けやすいと考え分離株について観察されたものと考え耐性展示ベースライン16、17、19、24から29以上の変化がないか、細菌の増殖ながら。 2キノロンを評価ラットでの研究と、このモデル32を使用して、マクロライドは、ベースラインと比較して、肺炎球菌における1-log 10の還元に必要なPK / PDの目標はと、より重要なのは、好中球減少マウスで決定された目標と相関し、ことを示しています市中細菌PNEUMのための臨床目標onia 6、7、34、35。 Gepotidacin、新たなメカニズムの抗生物質は、複数の肺炎球菌に対して試験し、それは好中球減少大腿モデルにおける1-log 10の還元に必要なように、この肺感染モデル31で1-ログイン10削減のための同様のPK / PDターゲットを必要としました36肺浸透を考慮に入れた(ファイルのデータ)。同様に、 緑膿菌に対するGSK2251052のためのマウスで決定したPK / PDのターゲットはうっ滞のための一致した、1-およびこの肺モデル30と好中球減少大腿感染モデル間のCFUで10削減肺への浸透が37と考えられていた、38を 2ログ。鼻腔内接種を使用して、好中球減少、肺感染モデルとの相関が不良でした。しかし、GSK2251052は、その研究38の静的応答よりも多くを生成しませんでした。これは6ログと比較して8ログ10 CFU /マウスであった高い細菌接種、に起因する可能性が<sub>好中球減少太もも37および気管内挿管30モデルで10 CFU /マウス。それは翻訳予測能力を評価するために、既存のモデルや臨床データとの相関との直接比較を可能にするようにこのようなデータの収集は、ベンチマークのために重要です。気管内挿管、肺感染モデルのより広範な使用は、分析のこれらのタイプの付加的なデータを提供します。
この免疫応答性肺炎モデルのいくつかの制限があります。まず、高い細菌接種は、一般的にあまりにも重症感染症におけるこのような研究結果を得るために必要なので、自然発生的な耐性の出現を評価するには適していません。ベースライン時7または8ログ10 CFUの細菌の負担を達成するための試みの後、急速な罹患率は、既存の毒素(ファイル上のデータ)を削除するには接種材料の完全な洗浄にもかかわらず、(24時間未満で瀕死になって、すなわち動物)が観察されています。それ大きなげっ歯類を使用することによって、この問題を克服することが可能です。ラット、特に重いラット(> 250g)を、より良いマウスと比較した研究のこれらのタイプのために適切であり得るように、より高い接種材料を許容するように見えます。病原体相互作用:第2の制限は、感染増強剤として寒天の使用は、特定のホストの評価のためのモデルを使用して排除することができるということです。感染が完全に肺内に確立されるまで、寒天、保護焦点を提供すると考えられます。この問題を克服するためにではなく、寒天よりも生理食塩水に接種物を提供することが可能です。しかしながら、唯一のいくつかの単離物の感染を生成することに留意すべきです。第三に、技術に堪能になるために必要な急な学習曲線があります。手順は、特にマウスでは、微妙なことができます。誤って食道に金属カニューレを配置することが容易であり、過度の力が食道や気管のいずれかのパンクにつながることができます。接種材料の慎重な配置もあります必要または動物が十分に感染している可能性が回復するかどうかではないかのいずれかであり得ます。スムーズかつ正確に、しかし、忍耐と忍耐力で、1は非常に習熟することができ、迅速な技術を実行します。
、好中球減少の必要性を除去する堅牢性と再現性を増加させる、研究者がより多くの病原体及び単離物を研究することができ、実験設計の柔軟性を向上させ、肺炎のための薬力学を特徴づけるために挑戦的な感染を設けることにより、この免疫応答性肺感染モデルは、抗生物質の発見に相当な付加価値をコミュニティ。追加の研究者によって、このモデルの使用の増加は、より広く受け入れを獲得し、適切な解釈のための支援情報を提供することを継続するのに必要なベンチマークを提供するのに役立ちます。
The authors have nothing to disclose.
JHは、まず私たちにこのモデルを教えるために認め、メンター、友人や元マネージャーヴァレリー・ベリーに感謝したいです。私たちの基礎を教え、抗菌PK / PDの分野へのコミットメントに影響を与えたとゲイリーWoodnutt、。すべての著者は、私たちの科学のための彼のサポートと感謝のためのデビッド・ペインに感謝したいです。我々は、これらの方法、特にピートDeMarsh、ロブ・ストラウブ、ロニ・ページとNerissaサイモンを使用して生成されたデータのボディに貢献し、私たちの元in vivoでの微生物学の同僚を承認したいと思います。最後に、私たちのおかげで、特に私たちが要求するすべてのMIC(リン・マクロスキー、ジョシュウェストとシャロン分)を提供するために、彼らの援助のために私たちのin vitro微生物学の同僚に移動します。そして、専門家のアドバイスやサポートを提供し、当社の臨床微生物学チーム(リンダ・ミラー、ニコールScangarella – オマーン、デボラ・バトラー)のために。
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Becton Dickinson and Company | 4321261 | |
Chocolate II Agar | Becton Dickinson and Company | 4321267 | |
BBL Brain Heart Infusion Broth Modified | Becton Dickinson and Company | 299070 | |
BBL Trypticase Soy Broth with 20% Glycerol | Becton Dickinson and Company | 297808 | storage media for frozen stock |
Inoculating loop | Nunc | 251586 | |
0.9% Sodium Chloride, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 0338-0048-04 | |
Difco Nutrient Agar | Becton Dickinson and Company | 213000 | |
30 ml free standing centrifuge tube with cap | EverGreen Scientific | 222-3530-G80 | |
50 ml Polypropylene Conical Tube 30 x115mm | Falcon, a Corning Brand | 352070 | |
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube 17 x 100mm | Falcon, a Corning Brand | 352059 | |
Guide Tool | Intek Services Ltd | GT01 | custom-made metal cannula for rats |
90' Portex tubing | SAI | POR-080-100 | plastic cannula for rats |
1 ml TB syringe slip tip | Becton Dickinson and Company | 309659 | |
PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
Animal feeding needle – straight 20×3" 2-1/4 | Popper and Sons, Inc | 7903 | used to create metal cannula for mice |
Intramedic polyethylene tubing | Clay Adams brand – Becton Dickinson and Company | 427401 | plastic cannula for mouse |
75 TN 5.0ul syringe 26s/2"/2 | Hamilton | 87930 | HPLC glass injection syringe |
Pyrex tube, culture 25×150 screwcap with rubber liner | Corning | 9825-25 | to autoclave/store metal cannulae |
70% isopropyl alcohol | Vi-Jon (Swan) | NDC 0869-0810-43 | |
Isoflurane, USP | Piramal Healthcare | NDC 66794-013-10 | |
Stomacher | Seward | Stomacher80 | |
Stomacher 80 classic bags | Seward | BA6040 | |
Assay plate, 96 well, round bottom | Costar, Corning Inc | 3795 | optional, for serial diluting |
Blood Omni Plates | Hardy | #A127 | optional, rectangular blood plates |