L'utilizzo della tecnica di sovrapposizione Soft-agar per lo screening composti inibitori bacterially Prodotto
Summary
We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Abstract
La tecnica di sovrapposizione di soft-agar è stato originariamente sviluppato più di 70 anni fa ed è stato ampiamente utilizzato in diverse aree della ricerca microbiologica, compreso il lavoro con i batteriofagi e batteriocine, agenti antibatterici proteici. Questo approccio è relativamente economico, con requisiti di risorse minime. Questa tecnica consiste individuare surnatante da un ceppo donatore (potenzialmente ospitare un composto tossico (s)) in un solidificata agar morbido che viene inseminata con un ceppo batterico di prova (potenzialmente sensibile al composto tossico (s)). Abbiamo utilizzato questa tecnica per lo screening di una libreria di Pseudomonas syringae ceppi per l'uccisione intraspecifica. Combinando questo approccio con una fase di precipitazione e delezioni geniche mirate, composti tossici più prodotte dallo stesso ceppo possono essere differenziati. I due agenti antagonisti comunemente recuperati utilizzando questa tecnica sono batteriofagi e batteriocine. Questi due agenti possono essere differenziati utilizzandodue semplici test aggiuntivi. Esecuzione di una diluizione seriale di un surnatante contenente batteriofago si tradurrà in singole placche diventando meno in numero con una maggiore diluizione, mentre la diluizione seriale di un surnatante contenente batteriocina comporterà una zona di compensazione che diventa uniformemente più torbida con una maggiore diluizione. Inoltre, un batteriofago produrrà una zona di compensazione quando trovato su un fresco morbido agar seminato con lo stesso ceppo, mentre una batteriocina non produrrà una zona di compensazione quando trasferito su un morbido prato fresco agar, a causa della diluizione del batteriocine.
Introduction
Recentemente, vi è stato un notevole interesse ad approfondire la nostra comprensione dell'ecologia microbica (in particolare le microbiomes di vari ambienti), così come i nuovi composti antibatterici da utilizzare nella lotta contro gli agenti patogeni resistenti agli antibiotici 1,2. Un tema di interconnessione tra questi interessi è la comprensione delle interazioni antagoniste tra i ceppi batterici nel loro ambiente naturale. Ci sono molti modi in cui i batteri antagonizzano concorrenti 3. Batteriocine, un gruppo eterogeneo di composti antibatterici, proteici, sono stati a lungo studiati per il loro ruolo nel mediare l'antagonismo interbatterica, con due delle specie più studiate essere Pseudomonas aeruginosa 4,5 e Escherichia coli 6, importanti agenti patogeni umani. Oltre a batteriocine, profagi indotte possono anche agire come agenti anticompetitor, consentendo un ceppo di invadere in una nicchia che è già colonizzato 7. Pseudomonas syringae è un patogeno pianta nota per produrre una serie di agenti antimicrobici, compresi singoli batteriocine proteiche 8, batteriocine coda derivato batteriofago 9 (tailocins chiamati), così come metaboliti secondari non proteici 10. Recentemente vi è stato interesse per capire come questi antimicrobici influenzano l'ecologia di questo organismo, così come il modo in cui possono essere utilizzate per controllare le malattie delle piante 11.
Un metodo ampiamente utilizzato per studiare sia batteriocine e batteriofago è la tecnica di sovrapposizione soft-agar. Questo metodo è stato descritto da Gratia nel 1936 agli aiuti di enumerazione batteriofago 12,13.
Qui si descrive l'applicazione del metodo di sovrapposizione soft-agar, in combinazione con mirata manipolazione genetica e polietilenglicole precipitazioni (PEG), nel distinguere fra tre diversi agenti antimicrobici (un batteriofago, un elevato peso molecolare bacteriocin, e un basso peso molecolare batteriocina) prodotto da un singolo ceppo batterico. Il vantaggio di questo approccio è che è relativamente semplice e poco costoso, che è il motivo per cui, nonostante sia decisamente 'low-tech', è ancora ampiamente utilizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica di sovrapposizione di soft-agar qui descritto è stato ampiamente applicato per molti decenni dai ricercatori interessati a batteriofagi o batteriocine. I principali vantaggi di questo approccio sono che è semplice, economico e relativamente facile da interpretare. Combinando la sovrapposizione soft-agar con PEG precipitazioni e la diluizione di serie, agenti antimicrobici possono essere separati in alto contro gli agenti a basso peso molecolare, e replicative vs non-replicativa agenti (cioè batteriofago vs. tailocin, rispettivamente). Infine, l'incorporazione di manipolazione genetica mirata (soppressione e complementazione) di batteriocine putativo o loci profago può fermamente stabilire l'identità di un dato composto antagonista. Abbiamo recentemente usato questo metodo per descrivere una nuova batteriofago di derivazione batteriocina prevalente tra Pseudomonas syringae ceppi 9.
I media di crescita e le condizioni indicate in questo lavoro protocollo bene per Pseudomonas syringae e probabilmente sufficiente per altri batteri Gram-negativi che crescono vigorosamente in queste condizioni. Tuttavia, i ricercatori utilizzano questo metodo vorranno ottimizzare i tempi, terreno di coltura, metodo di induzione, e temperatura di incubazione per il loro sistema. I parametri critici includono indurre la cultura produrre mentre nella fase di crescita logaritmica, nonché semina sovrapposizione soft-agar con sufficiente cultura fase logaritmica di garantire una distribuzione batterica uniforme, ma la cultura non eccessivo, che oscurare potenziali zone di compensazione. Ci sono molti batteriocine che non sono indotte come parte della risposta SOS, ma piuttosto sono indotti attraverso sistemi di rilevamento del quorum peptide-based (in particolare batteriocine Gram-positivi 15), in tal modo, un ricercatore può essere utile per lo screening diversi metodi di induzione diversi (come ad esempio modificando contenuto di nutrienti di indurre medio o consentendo di incubazione del ceppo produzione).
Quando si usaquesta tecnica, la sovrapposizione soft-agar deve essere accuratamente fusa e mantenuta a 55-60 ° C prima dell'aggiunta del ceppo semina. Abbiamo avuto diversi esperimenti in cui il soft-agar non è stato completamente fuso (anche se visivamente sembrava essere) e ha portato a una sovrapposizione con un aspetto granuloso. I risultati di una sovrapposizione granulosa possono ancora essere generalmente interpretabile, tuttavia, questo dipende dalla forza di inibizione (inibizione debole sarà più difficile osservare). Una variabile confondendo finale da considerare quando si utilizza questa tecnica è che la temperatura del agar fuso è consentito raffreddi prima dell'inoculo con il ceppo semina, in modo da evitare di uccidere il ceppo semina. Per evitare questo problema, possiamo garantire il soft-agar è caldo, ma non bollente, al tatto. Su questa linea, abbiamo anche osservato che se diamo il tempo insufficiente per una cultura di semina per ambientarsi al agar fuso, prima di versare la sovrapposizione, recuperiamo generalmente scarsa g battericaRESCITA, il che rende l'interpretazione di inibizione specifica difficili o impossibili da interpretare. Questo è il motivo per cui permettiamo 10-15 ulteriori secondi di incubazione tra vortex e versando la sovrapposizione. Il trade-off tra il mantenimento l'agar in uno stato completamente fuso (più caldo è meglio), ma non letale per il ceppo di semina (più caldo non è migliore) è quello che sarà probabilmente bisogno di essere determinato da un ricercatore attraverso tentativi ed errori.
Se viene utilizzata una fase di precipitazione PEG, sarebbe vantaggioso includere un controllo negativo in cui un mezzo di brodo sterile viene elaborato identico al supernatante della coltura. Questo farà sì che uccidere attività non è il risultato di PEG residua o cloroformio nel supernatante campione.
Poiché entrambe batteriofagi e batteriocine tendono ad essere altamente specifica, non è raro incontrare alcuna attività uccisione evidente con una data combinazione di ceppi. Ciò può derivare da una varietà di specifico ceppo remeccanismi sistance, uno è che il ceppo tester o manca o ha una versione non riconosciuta del recettore necessario per il targeting da un dato batteriocina o batteriofago.
Un metodo alternativo, metodo di screening batteriocine è stata descritta da Kawai et al. , Ma soffre di inconvenienti e non è stato ampiamente adottato 16. In particolare, questa tecnica richiede osservando campioni brodo a intervalli di tempo che possono essere onerose, e non consente la discriminazione tra attività di uccisione batteriofago-derivato e batteriocine-derivato.
I principali limiti di questa tecnica è che non è adatto per gli organismi che non crescono robusta (e quindi mancheranno zone di compensazione facilmente distinguibili) o che profagi porto o batteriocine che non sono prodotte con fermezza in condizioni di laboratorio. Adattamento di questa tecnica per rilevare batteriocine prodotte in campioni ambientali sarebbero sia espandere l'utilitàdi questa tecnica e facilitare una maggiore comprensione del ruolo di batteriocine all'interno di ambienti naturali.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Materials
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth’s Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
