Использование Soft-агара Техника для скрининга бактериально Производимые ингибирующие
Summary
We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Abstract
Метод наложения мягкого агара первоначально была разработана более 70 лет назад и широко используется в ряде областей микробиологических исследований, включая работу с бактериофагами и бактериоцинов, белковыми антибактериальных агентов. Такой подход является относительно недорогим, с минимальными потребностями в ресурсах. Этот метод состоит из пятнистость супернатант из штамма-донора (потенциально укрывает токсичное соединение (соединения)) на затвердевшей мягкой агара, который засевают бактериальным штаммом (тест потенциально чувствительного к токсичным соединением (ами)). Мы использовали эту технику для скрининга библиотека псевдомонас сиреневый штаммов , используемых для внутривидовой убийства. Комбинируя этот подход с стадии осаждения и целевых делеции гена, множественные токсические соединения, полученные тем же штаммом, могут быть дифференцированы. Два антагонистических агенты, обычно Восстановленные с помощью этой техники являются бактериофаги и бактериоцины. Эти два агента могут быть дифференцированы с помощьюдва простых дополнительных тестов. Выполнение последовательного разбавления на супернатант, содержащий бактериофаг приведет к отдельным бляшек становится все меньше числа с большим разведением, в то время как серийное разведение супернатанта, содержащего бактериоцин приведет очищающего зону, которая становится равномерно более мутной с большим разбавлением. Кроме того, бактериофаг произведет очищающего зону, когда пятнистый на свежую мягкую агара затравку того же штамма, в то время как бактериоцины не будет производить очищающего зону, переносили в свежую мягком агаре газоном, благодаря разбавлению бактерицин.
Introduction
В последнее время наблюдается значительный интерес к углублению нашего понимания экологии микроорганизмов ( в частности microbiomes различных сред), а также новые антибактериальные соединения для использования в борьбе с устойчивых к антибиотикам патогенов 1,2. Толкающей темой между этими интересами является понимание антагонистические взаимодействия между штаммами бактерий в их естественной среде. Есть множество способов , в которых бактерии антагонистами конкурентов 3. Бактериоцинов, разнообразная группа белковыми, антибактериальных соединений, уже давно изучена их роль в опосредовании межбактериальном антагонизм, с двумя из наиболее изученных видов , являющихся синегнойной 4,5 и кишечная палочка 6, важные патогены человека. В дополнение к бактериоцинов, индуцированные профаги могут также выступать в качестве anticompetitor агентов, позволяя штамм вторжение в нишу, которая уже колонизирована 7. Pseudomonas syringae это растение патоген известно, производят множество противомикробных агентов, в том числе один белок бактериоацинов 8, бактериофагов хвостовых происхождения бактериоацинов 9 (называемые tailocins), а также небелковые вторичных метаболитов 10. В последнее время наблюдается интерес к пониманию того, как эти противомикробные влияют на экологию этого организма, а также каким образом они могут быть использованы для борьбы с болезнями растений 11.
Широко используется метод изучения обоих бактериоцинов и бактериофагов является мягкой агара метод наложения. Этот метод был впервые описан в 1936 году Gratia на помощь в перечислении бактериофага 12,13.
Здесь мы описываем применение метода мягкого агара, в сочетании с целенаправленным генетической манипуляции и полиэтиленгликоль (ПЭГ) осаждения, в различении среди трех различных антимикробных агентов (бактериофаг, высокая молекулярная масса Bacteriocin, а вес Бактериоцин низкомолекулярный), полученный от одного штамма бактерий. Преимущество такого подхода заключается в том, что она является относительно простым и дешевым, поэтому, несмотря на его явно "низкотехнологичных", он до сих пор широко используется.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод наложения мягкого агар, описанный здесь широко применяется в течение многих десятилетий исследователями, заинтересованных в бактериофаги или бактериоцины. Основные преимущества такого подхода заключаются в том, что это просто, дешево и относительно легко интерпретировать. Объединив мягкого агара с ПЭГ осаждением и последовательным разбавлением, антимикробные агенты могут быть разделены на высокие по сравнению с агентами с низким молекулярным весом, и репликативному против нерепликативная агентов (т.е. бактериофаг против tailocin, соответственно). И, наконец, введение целевой генетической манипуляции (удаление и комплементарности) предполагаемых бактерицин или профага локусов может надежно установить личность данного антагонистического соединения. Недавно мы использовали этот метод , чтобы описать новый бактериофагом Бактериоцин распространена среди штаммов псевдомонас сиреневый 9.
Среды для выращивания и условия , указанные в данной работе протокола хорошо для Pseudomonas SYringae и, вероятно , достаточно для других грамотрицательных бактерий , которые растут интенсивно в этих условиях. Тем не менее, исследователи, использующие этот метод, нужно будет оптимизировать время, культуральной среды, метод индукции и температуры инкубации для своей системы. Критические параметры включают в себя индукцию продуктивный культуры в то время как в логарифмической фазе роста, а также засева мягкого агара с достаточной логарифмической фазы культуры, чтобы обеспечить равномерное распределение бактерий, но не чрезмерной культуры, которая будет заслонять потенциальные зоны клиринга. Есть много бактериоцины, которые не индуцируется как часть реакции SOS, а , скорее , индуцируются через пептидные на основе систем Кворум зондирования ( в частности , грамположительных бактериоацинов 15), таким образом, исследователь может хотят экран несколько различных методов индукции (такие , как изменение содержания питательных веществ индукции среды, или позволяя в течение длительного инкубации продуцирующего штамма).
Когда используешьэта техника, мягкая-агара должна быть тщательно расплавляют и выдерживают при температуре 55-60 ° С перед добавлением штамма высева. Мы провели несколько экспериментов, где мягкая-агар не был полностью расплавлен (хотя визуально она оказалась), в результате наложения с зернистость. Результаты зернистой накладкой по-прежнему может быть в целом интерпретируемым, однако, это зависит от силы торможения (более слабого торможения будет труднее заметить). Заключительное, путая переменной следует учитывать при использовании этого метода является то, что температура расплавленного агара дают достаточно времени для охлаждения до инокуляции штаммом высева, с тем, чтобы избежать убийства штамма высева. Чтобы избежать этой проблемы, мы обеспечиваем мягкий агар-тепло, но не жарко, на ощупь. Вдоль этих линий, мы также заметили, что если мы дадим недостаточное время для посева культуры акклиматизироваться к расплавленной агара, перед заливкой наложения, мы возвращаем в целом плохой бактериальный гrowth, что делает интерпретации специфического ингибирования трудно или невозможно интерпретировать. Вот почему мы позволяем 10-15 дополнительных секунд инкубации между встряхиванием и заливке накладку. Компромисс между сохранением агара в полностью расплавленном состоянии (горячее, тем лучше), но не смертельным для штамма высева (горячее не лучше) является тот, который, скорее всего, должны быть определены исследователем путем проб и ошибок.
Если стадию осаждения ПЭГ используется, было бы полезно, чтобы включать в качестве отрицательного контроля, где стерильный бульон среда обрабатывались идентично в культуральный супернатант. Это гарантирует, что убийство активность не является результатом остаточного PEG или хлороформа в образце супернатанта.
Поскольку оба бактериофаги и бактериоцины, как правило, весьма специфичны, это не редкость, не сталкиваться никакого очевидного убийства активности с данной комбинации штаммов. Это может быть результатом множества штаммоспецифический ремеханизмы низкоомными, один из которых, что штамм тестер либо отсутствует, либо имеет непризнанную версию рецептора, необходимого для ориентации на заданную бактерицин или бактериофага.
Альтернативный метод, Бактериоцин метод скрининга был описан Kawai и соавт. , Но страдает от недостатков и не был широко принят 16. В частности, этот метод требует наблюдения пробы бульона с интервалом времени, который может быть обременительным, и не допускает дискриминации между бактериофагом и бактериоциноподобные полученных деятельности убийства.
Основные недостатки этого метода является то, что он не очень хорошо подходит для организмов, которые не растут энергично (и, таким образом, будет не хватать легко различимые клиринговые зоны), или гавани профагов или бактериоцины, которые не производятся робастно в лабораторных условиях. Адаптация этой методики для обнаружения бактериоцины, произведенных в пробах окружающей среды будет и расширить полезностьэтой техники и облегчить более полное представление о роли бактериоцинов в пределах естественных условиях.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Materials
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
References
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth’s Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
