Clostridium difficile es una de las principales causas de las infecciones diarrea asociada a antibióticos nosocomiales ^1. Esta bacteria anaerobia Gram-positiva se transmite a través de su forma de esporas a través de la vía fecal-oral. En la última década, la nueva '' epidemia '' o '' hypervirulent '' (por ejemplo, las cepas de BI / NAP1 / 027) produjo un aumento drástico de las nuevas infecciones y las tasas de mortalidad en América del Norte y Europa ^2. C. difficile enfermedad -asociado (CDAD) es una amenaza para la vida inflamación del colon con altas tasas de mortalidad ^3. Los síntomas varían desde diarrea ⁴ a ⁵ colitis pseudomembranosa y el megacolon tóxico menudo fatal ^6.

El tratamiento de la CDAD es difícil, ya que las cepas virulentas son resistentes a múltiples fármacos y la tasa de recurrencia es alto ^7. En la terapia de momento incluye el metronidazol antibióticos, fidaxomicina o vancomicina, o en repetitivamente los casos recurrentes de trasplante fecal microbiota. Se necesitan con urgencia ⁸ nuevas estrategias terapéuticas. Algunos avances se registra como el anticuerpo monoclonal terapéutico Bezlotoxumab, apuntando a la toxina de C. difficile B ^9, recientemente ha superado con éxito la fase III de ensayos clínicos y fue presentado para su aprobación por la FDA y EMA. Además, los nuevos antibióticos se están probando en el momento en diferentes etapas de los ensayos clínicos ^10.

Para desarrollar un tratamiento eficaz nuevas dianas terapéuticas deben ser identificados. El recientemente descubierto C. difficile proteasa endopeptidasa-1-prolina prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) es un objetivo tan prometedor, ya que la falta de PPEP-1 en una cepa knock-out disminuye la virulencia de C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 es una metaloproteasa secretada ^12,13 escindir dos adhesinas de C. difficile en su C-terminal ¹³ liberando así la bacter adherenteia del epitelio intestinal humano. Por lo tanto, está implicado en el mantenimiento del equilibrio entre el fenotipo sésiles y móviles de C. difficile. Para desarrollar inhibidores selectivos contra PPEP-1 y para entender la forma en que reconoce sus sustratos conocimiento íntimo de su estructura tridimensional es indispensable. Hemos resuelto la primera estructura cristalina de PPEP-1 sola y en complejo con un péptido sustrato ^14. PPEP-1 es la proteasa primera sabido que selectivamente escinde enlaces peptídicos entre dos residuos de prolina ^15. Se une el sustrato de una manera de doble retorcido y la estabiliza a través de una red alifático-aromático prolongado de residuos localizados en el S-bucle que cubre el sitio activo de la proteasa ^14. Este modo de unión al sustrato es aplicable sólo a PPEP-1 y no se encuentra en proteasas humanas hasta la fecha. Esto hace que sea un objetivo prometedor fármaco, y fuera de objetivo efectos de los inhibidores muy improbables.

Para el desarrollo y la pantalla selectiva PPEP-1 inhibitors en el futuro se necesita una gran cantidad de proteína pura y monodispersa PPEP-1. Además, para determinar el modo de unión de los primeros inhibidores, estructuras co-cristalinas con PPEP-1 tendrá que ser determinado. En nuestras manos PPEP-1 produce constantemente cristales intergrown. Por lo tanto, hemos desarrollado un procedimiento de optimización para producir monocristales calidad de difracción de PPEP-1. En este protocolo se describe en detalle la solución de producción, purificación, cristalización y la estructura de PPEP-1 ^14. Utilizamos la expresión intracelular en Escherichia coli de una variante PPEP-1 carece de la secuencia señal de secreción, cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión de tamaño con la eliminación de la etiqueta de purificación, seguido por microsiembra ¹⁶ en una pantalla de la optimización y la determinación de la estructura a través de zinc única longitud de onda de dispersión anómala (zinc-SAD) ^17. Este protocolo puede ser adaptado para la determinación de la producción y la estructura de otras proteínas (por ejemplo, </ Em> metaloproteasas) y en particular para las proteínas que producen cristales entrecrecidos. A petición, el ADN del plásmido de la construcción (pET28a-NHis-rPPEP-1) y los datos de difracción se puede proporcionar con fines educativos.