Clostridium несговорчивый является одной из основных причин внутрибольничных антибиотик-ассоциированной диареи инфекций ^1. Этот грамположительных анаэробной бактерии передается через споровой форме через фекально-оральным путем. В последнее десятилетие, новая '' эпидемия '' или '' гипервирулентных '' штаммов (например , BI / NAP1 / 027) вызвало резкое увеличение числа новых инфекций и летальности в Северной Америке и Европе ^2. C. несговорчивый -associated болезнь (РЕТЕНЦИИ) является опасным для жизни воспаление толстой кишки с высоким уровнем смертности ^3. Симптомы варьируются от диареи ⁴ до псевдомембранозного колита ⁵ и часто со смертельным исходом токсического мегаколон ^6.

Лечение РЕТЕНЦИИ трудно , как вирулентные штаммы с множественной лекарственной устойчивостью и частота рецидивов высока ^7. В данный момент терапия включает в себя антибиотики метронидазол, fidaxomicin или ванкомицин, или в repetitiVely рецидивирующие случаи фекальные трансплантации микрофлора. Новые терапевтические стратегии срочно необходимы ^8. Определенный прогресс записывается в качестве терапевтического моноклональных антител Bezlotoxumab, нацеливание C. несговорчивый токсин B ^9, недавно успешно прошел III фазы клинических испытаний и был подан на утверждение с FDA и EMA. Кроме того, новые антибиотики испытываются в данный момент на разных стадиях клинических испытаний ^10.

Для разработки эффективного лечения новые терапевтические мишени должны быть идентифицированы. Недавно обнаруженный C. несговорчивый протеазы пролин-пролина эндопептидазы-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) является таким перспективной мишенью, как отсутствие PPEP-1 в нокаут-штамм уменьшает вирулентность C . несговорчивый в естественных условиях ^11. PPEP-1 представляет собой секретируемый металлопротеазы ^12,13 расщепляющие два C.difficile , адгезинов на их С-конца ¹³ , таким образом , освобождая клейкий BacterИ. из человеческого кишечника эпителия. Таким образом, она участвует в поддержании баланса между сидячим и мотильных фенотипа C. несговорчивый. Для разработки селективных ингибиторов против PPEP-1 и понять, как он признает свои субстраты глубокое знание его трехмерной структуры является необходимым условием. Мы решили первую кристаллическую структуру PPEP-1 по отдельности и в комплексе с субстратом пептида ^14. PPEP-1 является первой известной протеазы , которые селективно расщепляет пептидные связи между двумя остатками пролина ^15. Он связывает субстрат в двойном перекручены образом и стабилизирует его через расширенную жирноароматических сеть остатков , расположенных в S-петле , которая покрывает протеазы активного сайта ^14. Этот режим субстратсвязывающих является уникальным для PPEP-1 и не нашли в человеческих протеаз на сегодняшний день. Это делает его перспективным объектом наркотиков, и вне мишени эффекты ингибиторов очень маловероятно.

Для разработки и экрана селективного PPEP-1 вдыханиеibitors в будущем требуется большое количество чистой и монодисперсному PPEP-1 белка. Кроме того, для определения режима связывания первых ингибиторов, со-кристаллических структур с PPEP-1 должны быть определены. В наших руках PPEP-1 постоянно производит сросшиеся кристаллы. Таким образом, мы разработали процедуру оптимизации для получения монокристаллов дифракционного качества PPEP-1. В этом протоколе мы опишем подробно производства, очистки, кристаллизации и структуру раствора PPEP-1 ^14. Мы используем внутриклеточную экспрессию в кишечной палочки из более PPEP-1 варианта , лишенного сигнальной последовательности секреции, аффинной хроматографии и гель -проникающей хроматографии с удалением метки очистки, а затем microseeding ¹⁶ в экране оптимизации и определения структуры с помощью цинка монохромному аномальной дисперсии (цинк-SAD) ^17. Этот протокол может быть адаптирован для определения производства и структуры других белков (например , </ EM> металлопротеаз) и, в частности, для белков, производящих сросшиеся кристаллы. По запросу ДНК плазмиды конструкции (pET28a-Nhis-rPPEP-1) и дифракционные данные могут быть предоставлены для образовательных целей.