従来のUVレーザー共焦点顕微鏡を用いて細胞ストレスと死のトリガ

注：デザイン、行動、および動物実験の報告は現行のガイドライン15を考慮しなければなりません。このような作業は地元の動物福祉機関によって事前に承認されなければならない（私たちの場合には、マッコーリー大学の動物倫理委員会）。 1.マウントとUV細胞除去のためのゼブラフィッシュを準備ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）の蛍光タンパク質を発現を生成します。 、ゼブラフィッシュで関心の蛍光タンパク質を発現する（他の場所で16説明したように）ゼブラフィッシュの卵の1細胞期にプラスミド注射を実行したり、蛍光トランスジェニック系統を使用します。複数の細胞型にラベルを付けるには、関心の質問に関連する確立されたトランスジェニック系統を交配することによって化合物のトランスジェニックゼブラフィッシュラインを作成します。夕方に偽底ペア交配タンクの両側に1人の男性と一人の女性ゼブラフィッシュを置き、光の発症と仕切りを削除翌朝（他の場所で17詳述）。 28℃でのゼブラフィッシュを維持し、確立されたプロトコール17、18に従ってそれらを扱います。 プラスチック茶漉しを通して胚を含む水槽の水に負担することによって成功した産卵後の胚を収集します。システム水と卵をすすぎ、ペトリ皿に卵、水にそれらを転送します。 受精を決定するために光学顕微鏡下でそれらを調べます。ストアは、ペトリ皿に卵を受精し、28°C 18のインキュベーターに置いてください。 オプション：特定の細胞集団を標識するためにマイクロインジェクションを実行します。 注：これは、安定したトランスジェニック株を上げる必要なく、タンパク質の発現および可視化を可能にする別の方法です。目的のタンパク質は毒性であり、安定したトランスの発生を禁止する場合は、この方法が有利ですジェニックライン。 他の場所19、20、21に記載のように、ゼブラフィッシュ胚の1細胞期へのプラスミド構築物を注入します。 注：この方法は、目的のタンパク質のモザイク発現をもたらします。 Tol2のにより隣接選択肢のプロモーターから駆動され、目的のタンパク質（ 例えば、22、-3mnx1 23、24を islet1、25、またはMPEG1 26に 会ったが ）リピート20を反転しました。 所望のサイズに魚を熟成。 3に魚を上げる – 5日後に受精（DPF）および蛍光化合物の顕微鏡下に配置します。適切な蛍光体の発現のための動物を選別し、明るく標識された魚を選択します。後半に埋め込むために卵と水と別の皿に適切な幼虫を分離（28℃のインキュベーター内店舗）の研究。 オプション：胚は、色素沈着の形成を阻害するために24時間後に受精（HPF）で0.2mMの1-フェニル-2- thioures（PTU）リンゲル液に配置することができます。それは毒性があり、有害な生理学的、遺伝的、または形態学的な効果を持つことができるようにケアは、PTUで撮影する必要があります。 初期の発達段階（<2 DPF）での研究のために、シャープな鉗子を使用して手動で胚をdechorionate。卵水にプロナーゼ（2mg / ml）を添加し、28℃で10分間、それらをインキュベートすることにより酵素的に胚の多数Dechorionate。 dechorionationを容易にするためにプラスチック製のパスツールピペットを介して定期的に胚を渡します。胚の大部分が卵の水でそれらを数回洗浄することによって、それらの絨毛膜から浮上しているプロセスを終了します。 アガロースでのゼブラフィッシュの埋め込みのためのソリューションを準備します。 4g添加することによって、麻酔液を調製/ L MS222（トリカインストック溶液、pH7.0）に卵水を含むペトリ皿に滴下しました。 50mg / Lの用量が推奨される開始点（ 図1A）です。 卵水に – （1.5〜0.8％）と1.5 mLのマイクロ遠心チューブにそれを分取低融点アガロースの株式を準備します。予熱したヒートブロックにアリコートを置き（38から40°C）、それが設定温度（〜30分; 図1B）に平衡化しましょう。 オプション：長期的なイメージング（> 4時間）については、35 mmのガラスボトムシャーレ内で少しアガロース円を準備し、それが（ 補足図1）を設定することができます。 注：この余分なステップは、より長い時間枠にわたってゼブラフィッシュと全体アガロースドロップのあらゆる動きを回避することに有効でした。 魚を置くている途中で少し開口を有するドーナツ状の円を準備するガラスボトムディッシュの内側の円に沿って、アガロースのように行うには、場所〜300μL（ステップ1.5.3; 補足図1） 。 顕微鏡観察のためにアガロースにゼブラフィッシュをマウントします。 アブレーションのために事前スクリーニング魚の3と麻酔液（; 図1C;約5分ステップ1.4.1）で皿に（トランスファーピペットを使用して）、それらを転送することにより幼虫を麻酔- 1を選択します。 注：彼らは浅いふたの動きと減少した心拍数を表示したときに、魚麻酔し、もはや（TEER;離れて泳ぐの失敗は、後に軽くブラシで自分の尾に触れる）タッチ誘発エスケープ応答を表示しません。魚の倫理的な処置のための適切な麻酔を確認し、蛍光灯へのアガロースまたは曝露への転送時にけいれんを防ぐために。 麻酔が確認された後、（カットオフ200-μLチップセットへの〜30μLで）調整可能なピペットを用いて幼虫を吸うと、それは先端の底に沈むましょう。液体の滴を放出することによって予熱したアガロース（ステップ1.4.2）に幼虫を移しアガロースに幼虫（アガロースに入る卵水の量を最小限に抑えるようにしてください; 図1D）。 アガロースに囲まれた魚を吸います。先に調製したガラスボトム35mmの皿に迅速に分注します。 ボディと尾部が（ 図1E）平らになるように、側のアガロース（左ヘッド）内で動物を配置するために解剖顕微鏡と標準のペイントブラシ（ロングライナー、サイズ1）を使用します。複数の魚を扱う場合、それらは後で簡単に共焦点顕微鏡を使用して位置するように皿にすべての魚を揃えます。 注：すばやく位置決めと整列のこの手順を実行する（アガロースは寒い温度に暴露した後、すぐに設定を開始するように、それはいくつかの練習が必要な場合があります）。 アガロースがしっかりと設定されるまで15分 – 10のためのアガロース包埋魚を残します。注意深く〜2 mLの卵の水を含むトリカイン（ 図1F）と35 mmのペトリ皿をトップアップ。 2.共焦点顕微鏡およびイメージングパラメータを設定します共焦点顕微鏡のステージ上の埋め込み幼虫とペトリ皿を置き、（明視野を使用して）動物脊髄の背側に焦点を当てます。適切な倍率（40X）と蛍光設定で動物を調べ、それに続くアブレーション（ 図2）のために必要なすべての撮像パラメータであることを確認するために、関心のある構造（ 例えば、標識されたニューロンまたはミクログリア運動の蛍光強度）を視覚化します。私たちは日常的に私たちの時間経過の研究を行うために40Xの対物レンズを使用しています。 オプション：数時間タイムラプス研究を行うためには、非摂動生理細胞の応答とその環境（ 例えば、ベースラインの速度を確立するミクログリアの動きを確立するために、前の切除に単一または少数の時点を記録することをお勧めしますおよび運動性）。 構造体の厚さを決定UVレーザーアブレーションのために関心のURE。 Zドライブを使用して、手動で焦点を当てダウンによって関心の構造（ 例えば、細胞体）の上下を確認してください。切除されますz面を下に注意してください（ 例えば、セルの中心）。 注：（アブレーション後に簡単なタイムラプス可視化を可能にする高い信号対雑音比、 例えば、 図4）の経験から、この方法は、明るく標識した脊髄神経細胞を標的とすることによって、最も効果的であったとの中央を切除することにより、細胞体。細胞核の蛍光は、正しい標的と高いアブレーション効率を保証するために有利であり得ます。 3.ゼブラフィッシュ脊髄に個々の細胞の標的化レーザーアブレーションを実行します注：このアブレーションおよび可視化手法については、共焦点顕微鏡（ライカSP5）を用いました。細胞特異destに405 nmのダイオードを使用してアブレーション手技騒動は、ソフトウェア（ライカアプリケーションスイート、v2.7.3.9723）に従って詳述されています。しかし、405 nmのレーザー、FRAP（退色後蛍光回復）または漂白モジュールが装備されている任意の従来の共焦点顕微鏡は、潜在的に、わずかに異なる設定、パラメータ、および名前で、同じセル操作のパフォーマンスができるようになります。 ソフトウェアメニュー（ 図3A、1及び2）の上部にあるドロップダウンメニューをクリックしてFRAPウィザードを起動します。レーザーアブレーションのための特定のパラメータ（ 図3B、3）のセットアップを可能にする異なるステップで新しいウィンドウを観察します。 フォーマット、走査速度（ 図3B、4） を選択し、平均することによりアブレーションアプローチの画像パラメータを決定する（図3B、5）。 400ヘルツの走査速度で1,024×1024の画像フォーマットとライン4の平均は最も適用しました。 注：彼らは以前の買収に決定されているように、（このような励起または放射パラメータなど）のスペクトル検出を変更する必要は一般的にありません。 アブレーション用のz平面は、既に（ステップ2.4に記載のように）選択されていない場合、押し「ライブ」ボタンとアブレーションされようとしている蛍光性の構造または所望のz平面になるまで、試料を通って焦点を合わせます焦点があっている。 一般的な画像パラメータを設定したら、「漂白剤」ステップ（ 図3C、6）特定のアブレーション要素を制御するためにアクセスします。 注：レーザ強度の組み合わせ（ 図3C、8）、走査速度、およびステップ3.2に設定された平均（ 図3B、4及び5）、並びにに設定される繰り返しの回数、3.5（ 図3Eのステップ12）、したがって漂白効率のROIでのUVレーザの全体的な滞留時間を決定し、あろう。 漂白手順（ 図3C、8）のためにそれを活性化することにより、405 nmのレーザーを係合します。 注： – 私たちの実験で80％上記の設定で、ほとんどの成功は、60との間に405 nmのレーザー強度で達成されました。このレーザー出力が機器固有のものであることに注意してください、すべての共焦点セットアップに異なります。 したがって、滞留時間を最大化する、スキャンフィールドを減少させることによって選択されたROIで漂白強度を最大化するためのオプション「ズームイン」（ 図3C、7） を使用します 。また、このプロセスのための選択のソフトウェアの「ブリーチポイント」オプションを使用します。 画像取得風に描画ツールのいずれかを使用してアブレーションするための1つまたは複数のROI（ 図3D、10） を選択OW（ 図3D、9）。 8ミクロン – 約4の円形の描画ツールで、例えば、軸索小丘をターゲットにしています。 注：切除領域は、用途に応じて、単一の画素から大きな面積に調整可能です。 ROIを確立した後、「時間経過」ボタン（ 図3E、11） を選択したROIが（ 図3E、12）アブレーション/スキャンされるサイクル数を確認します。漂白工程の後に直前と直後に画像全体の概要を可能にするために所望のように「プリブリーチ」と「ポスト・ブリーチ」フレームを選択してください。 すべての必要なアブレーションパラメータを確立した後、プレス「ファイル名を指定して実行実験」（ 図3E、13）とアブレーションの効率を監視します。 注：私たちのFRAPのセットアップでは、単一の画像は、適切なレーザーeでFRAPサイクルの前と後に撮影されますxcitation（EGFP発現細胞のために例えば、488 nm励起）。これら前後のアブレーション画像は、選択されたアブレーション・パラメータがあったか満足にROIを漂白して、どのように効果的なの迅速な判断を可能にします。 場合に選択されたROIはまだ完了後に高い蛍光強度を示すレーザ強度（ 図3C、8）、スキャン速度と平均（ 図3B、 図4、図 5）を調整することにより、プロセスを繰り返し、繰り返し（ 図3E、12） FRAPサイクル。 4.「レスキュー」または処分魚を含め、フォローアップの手順を実行します実験が端末である場合は、トリカインの過剰摂取で動物を安楽死させます。卵、水を除去し、10分間麻酔原液と交換してください。安楽死を確実にするために、ハートビートの停止のために顕微鏡下で確認してください。 任意：実験が端末でない場合、細かい鉗子やブラシでアガロースから慎重に魚を削除します。新鮮な卵水に魚を置き、15分間の観察下に回復することができます。通常の遊泳行動が返された場合、インキュベーターに魚を戻します。 機関の承認GMOの廃棄物の流れに応じてトランスジェニック動物を処分してください。