Déclenchement Stress cellulaire et la mort Utilisation conventionnelle UV Laser Microscopie confocale

NOTE: Conception, conduite, et les rapports de l' expérimentation animale doivent tenir compte des lignes directrices actuelles 15. Ce travail doit être approuvée au préalable par l'autorité de protection des animaux local (dans notre cas, le Comité d'éthique animale de l'Université Macquarie). 1. Préparer le Zebrafish pour le montage et UV Cellule Ablation Générer zebrafish (Danio rerio) exprimant des protéines fluorescentes. Pour exprimer des protéines fluorescentes d'intérêt chez le poisson zèbre, effectuer des injections de plasmide dans le stade d' une cellule de l'œuf de poisson zèbre (comme décrit ailleurs 16) ou utiliser des lignées transgéniques fluorescents. Pour marquer plusieurs types de cellules, de créer des lignes de poisson zèbre transgénique composé en croisant lignées transgéniques établies pertinentes à la question de l'intérêt. Placez un mâle et une femelle zebrafish de chaque côté d'une paire réservoir d'accouplement faux-fond dans la soirée et retirez le diviseur avec l'apparition de la lumièrele lendemain matin (comme détaillé ailleurs 17). Gardez le poisson zèbre à 28 ° C et les traiter selon les protocoles établis 17, 18. Recueillir les embryons après la ponte réussie en filtrant l'eau du réservoir contenant les embryons à travers une passoire à thé en plastique. Rincer les oeufs avec l'eau du système et de les transférer dans l'eau d'œuf dans une boîte de Pétri. Examinez-les sous un microscope optique pour déterminer la fertilisation. Magasin d' œufs fécondés dans une boîte de Pétri et les placer dans un incubateur à 28 ° C 18. Facultatif: Effectuez une microinjection pour étiqueter des populations de cellules spécifiques. NOTE: Ceci est une méthode alternative qui permet l'expression et la visualisation des protéines, sans la nécessité d'élever des lignées transgéniques stables. Ce procédé est également avantageux que la protéine d'intérêt est toxique et interdit la génération d'un trans stablelignes géniques. Injecter les constructions plasmidiques dans le stade d' une cellule d'embryons de poisson zèbre, comme décrit ailleurs 19, 20, 21. NOTE: Cette méthode se traduit par l'expression mosaïque de la protéine d'intérêt. La protéine d'intérêt est entraîné par un promoteur de choix (par exemple, islet1 22, -3mnx1 23, 24, a rencontré 25 ou MPEG1 26) flanqué de Tol2 répétitions inversées 20. Âge du poisson à la taille désirée. Soulever le poisson à 3 – 5 jours après la fécondation (dpf) et les placer sous un microscope composé fluorescent. Tamiser les animaux pour l'expression de fluorophore approprié et sélectionnez le poisson brillamment marqué. Séparer les larves approprié dans un autre plat avec de l'eau d'œuf pour l'enrobage finr sur (stocker dans un 28 ° C incubateur). Facultatif: Les embryons peuvent être placés dans un 1-phényl-2-thioures solution 0,2 mM (PTU) Ringers à 24 h après la fécondation (HPF) pour inhiber la formation de la pigmentation. Des précautions doivent être prises avec PTU, car il est toxique et peut avoir physiologique indésirable, génétiques ou des effets morphologiques. Pour les études à un stade de développement précoce (<2 dpf), dechorionate les embryons manuellement à l'aide des pinces coupantes. Dechorionate grand nombre d'embryons par voie enzymatique par addition de pronase (2 mg / ml) dans l'eau de l'oeuf et en les incubant pendant 10 min à 28 ° C. Passez les embryons périodiquement à travers une pipette Pasteur en plastique pour faciliter dechorionation. Termine le processus lorsque la majorité des embryons ont émergé de leurs chorions en les lavant plusieurs fois avec de l'eau d'œuf. Préparer des solutions pour l'incorporation dans zebrafish agarose. Préparer une solution d'anesthésie en ajoutant 4 g / L MS222 (solution de tricaïne, pH 7,0)goutte à goutte à une boîte de Pétri contenant de l'eau d'oeuf. Une dose de 50 mg / L est un point de départ recommandée (Figure 1A). Préparer un stock de bas point de fusion d'agarose (0,8 à 1,5%) dans l'eau d'œuf et aliquoter dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Placer une aliquote dans un bloc thermique préchauffé (38 – 40 ° C) et laisser équilibrer à la température de consigne (~ 30 min, figure 1B). Facultatif: Pour l' imagerie à plus long terme (> 4 h), préparer un petit cercle d' agarose dans le 35 mm boîte de Pétri à fond de verre et de lui permettre de fixer (figure supplémentaire 1). REMARQUE: Cette étape supplémentaire a été efficace pour éviter tout mouvement de l'ensemble goutte d'agarose avec le poisson zèbre sur des délais plus longs. Pour ce faire, le lieu ~ 300 pi d'agarose le long du cercle intérieur de la boîte à fond de verre pour préparer un cercle en forme de beignet avec une petite ouverture au milieu dans lequel placer le poisson (étape 1.5.3; complémentaire Figure 1) . Monter le zebrafish en agarose pour la microscopie. Sélectionner 1 – 3 de poisson pré-sélectionnés pour l' ablation et anesthésier les larves en les transférant ( à l' aide d' une pipette de transfert) dans un récipient avec la solution d'anesthésie (étape 1.4.1; figure 1C; environ 5 minutes). NOTE: Les poissons sont anesthésiés quand ils montrent un mouvement des opercules peu profonde et une diminution du rythme cardiaque et de ne plus afficher une réaction de fuite tactile évoqué (TEER, à défaut de nager loin après doucement toucher leur queue avec une brosse). Assurer une anesthésie appropriée pour le traitement éthique des poissons et pour éviter des secousses lors d'un transfert en agarose ou exposition à la lumière fluorescente. Après l'anesthésie est confirmée, aspirer une larve à l'aide d'une pipette réglable (avec un 200-pi pointe de coupure réglée sur ~ 30 pi) et laisser couler au fond de la pointe. Transférer la larve dans l'agarose préchauffé (étape 1.4.2) en libérant une goutte de liquide avec lelarve dans l'agarose (essayer de minimiser la quantité d'eau d'oeuf entrer dans l'agarose, la figure 1D). Aspirer le poisson entouré d'agarose. Distribuer rapidement dans le 35 mm plat à fond de verre préalablement préparé. Utiliser un microscope de dissection et un pinceau standard (long liner, taille 1) pour positionner l'animal dans l'agarose sur le côté (tête vers la gauche) , de sorte que le corps et la queue sont à plat (figure 1E). Si vous travaillez avec plusieurs poissons, aligner tous les poissons dans le plat de sorte qu'ils sont faciles à localiser à l'aide du microscope confocal plus tard. REMARQUE: effectuer rapidement cette procédure de positionnement et d'alignement (il peut exiger une certaine pratique, comme l'agarose commence à mettre immédiatement après l'exposition à des températures plus froides). Laissez le poisson d'agarose-embedded pendant 10 – 15 min jusqu'à ce que l'agarose est fixé fermement. Top soigneusement le 35 mm boîte de Pétri avec ~ 2 mL d'oeuf eau contenant tricaïne (figure 1F). 2. Mettre en place le microscope confocal et paramètres d'imagerie Placez la boîte de Pétri avec la larve embarquée sur la platine du microscope confocal et se concentrer sur la face dorsale de l'animal de la moelle épinière (utilisant un champ lumineux). Examiner l'animal sous le grossissement approprié (40X) et le réglage fluorescent et visualiser la structure d'intérêt (par exemple, l' intensité de fluorescence des neurones marqués ou mouvement microglie) pour confirmer que tous les paramètres d'imagerie sont aussi nécessaires pour l' ablation ultérieure (Figure 2). Nous utilisons régulièrement l'objectif 40X d'effectuer nos études time lapse. Facultatif: Pour effectuer une étude time-lapse pendant plusieurs heures, il est conseillé d'enregistrer un seul ou quelques points de temps avant l'ablation d'établir la réponse physiologique non perturbé de la cellule et son environnement (par exemple, le mouvement microgliale pour établir la vitesse de référence et la motilité). Déterminer l'épaisseur de la structure d'intérêt pour l'ablation par laser UV. Utilisation de la z-drive, vérifiez le haut et le bas de la structure d'intérêt (par exemple, le soma cellulaire) par mise au point manuelle de haut en bas. Notez le plan-z qui sera soumis à une ablation (par exemple, le centre de la cellule). NOTE: De l' expérience, cette méthode était la plus efficace en ciblant les neurones de la moelle épinière qui ont été brillamment marqués (un rapport signal-bruit élevé qui permet facilement la visualisation time-lapse après l' ablation, par exemple, la figure 4) et par ablation du milieu de la soma cellulaire. fluorescence cellulaire noyau peut être avantageux pour assurer le ciblage correct et une grande efficacité de l'ablation. 3. Effectuer ciblée Laser Ablation des cellules individuelles dans la moelle épinière Zebrafish NOTE: Pour que cette approche d'ablation et de visualisation, un microscope confocal (Leica SP5) a été utilisé. La procédure d'ablation en utilisant une diode de 405 nm pour dest spécifique à la celluleruction est détaillé en fonction du logiciel (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Cependant, tout microscope confocal classique qui est équipé d'un laser de 405 nm et une FRAP (récupération de fluorescence après photoblanchiment) ou d'un module de blanchiment va permettre l'exécution des mêmes manipulations cellulaires, mais éventuellement avec des paramètres légèrement différents, les paramètres et les noms. Lancez l'assistant de FRAP en cliquant sur le menu déroulant en haut du menu du logiciel (figure 3A, 1 et 2). Observer une nouvelle fenêtre avec les différentes étapes permettant la mise en place des paramètres spécifiques pour l'ablation laser (figure 3B, 3). Déterminer les paramètres de l' image pour l'approche d'ablation en sélectionnant le format, la vitesse de balayage (figure 3B, 4) et la moyenne (figure 3B, 5). Un format d'image de 1.024 x 1.024 à une vitesse de balayage de 400 Hz et une lignemoyenne de 4 était plus applicable. NOTE: Il est généralement pas nécessaire de modifier la détection spectrale (tels que les paramètres d'excitation ou d'émission), comme ils l'ont été déterminées dans l'acquisition précédente. Si le plan z pour l'ablation n'a pas déjà été sélectionné (tel que décrit à l'étape 2.4.), Appuyez sur le bouton "Live" et de se concentrer à travers l'échantillon jusqu'à ce que la structure fluorescente ou le z-plan désiré qui va être ablatée est au point. Une fois les paramètres d'image généraux sont définis, accéder à l'étape "Bleach" (figure 3C, 6) pour contrôler les composants spécifiques d'ablation. NOTE: Une combinaison de l'intensité du laser (figure 3C, 8), la vitesse de balayage, et la moyenne qui a été défini à l' étape 3.2 (figure 3B, 4 et 5), ainsi que le nombre de répétitions qui sera mis en l' étape 3.5 (Figure 3E,12), détermine le temps de séjour global du laser UV à la ROI, et par conséquent, l'efficacité de blanchiment. Engager le laser à 405 nm en l' activant pour le procédé de blanchiment (figure 3C, 8). NOTE: La plupart de succès avec les paramètres mentionnés ci-dessus a été réalisée avec 405 nm intensités laser entre 60 – 80% dans notre dispositif expérimental. Soyez conscient que cette puissance de sortie de laser est spécifique à l'instrument et sera différent pour chaque configuration confocale. Utilisez la fonction "zoom" l' option (figure 3C, 7) afin de maximiser l'intensité de blanchiment à la ROI sélectionnée en réduisant le champ de balayage, donc maximiser le temps de séjour. Vous pouvez également utiliser l'option «point de Bleach" du logiciel de choix pour ce processus. Sélectionnez un ou plusieurs ROIs (Figure 3D, 10) pour l'ablation en utilisant l' un des outils de dessin dans le vent d'acquisition d'imageow (Figure 3D, 9). Cibler le tertre axone, par exemple, avec l'outil de dessin circulaire d'environ 4 à 8 pm. REMARQUE: La zone d'ablation est ajustable à partir d'un pixel unique dans une zone plus large, en fonction de l'application. Après avoir établi le retour sur investissement, sélectionnez le bouton "Course Time" (Figure 3E, 11) et confirmer le nombre de cycles ROIs sera numérisé / ablatée (Figure 3E, 12). Choisissez l'option "Pré-blanchiment" et cadres "Post-Bleach" comme souhaité pour permettre un aperçu de l'ensemble de l'image juste avant et immédiatement après le processus de blanchiment. Après avoir établi tous les paramètres d'ablation nécessaires, appuyez sur "Experiment Run" (Figure 3E, 13) et de surveiller l'efficacité de l'ablation. NOTE: Dans notre configuration de FRAP, une seule image sera prise avant et après le cycle de FRAP avec le e laser appropriéXCitation (par exemple, 488 nm d' excitation pour les cellules exprimant EGFP). Ces images pré et post-ablation permettent un arrêt rapide de la façon satisfaisante le retour sur investissement a été blanchi et dans quelle mesure les paramètres d'ablation choisis étaient. Répétez le processus en ajustant l'intensité du laser (figure 3C, 8), la vitesse de balayage et la moyenne (figure 3B, 4 et 5), et les répétitions (Figure 3E, 12) dans le cas où le ROI sélectionné montre encore à haute intensité de fluorescence après l' achèvement du cycle de FRAP. 4. Effectuez la procédure de suivi, y compris les poissons "Rescue" ou élimination Si l'expérience est terminal, euthanasier l'animal avec une surdose de tricaïne. Retirer l'eau d'œuf et le remplacer par la solution mère anesthésie pendant 10 min. Pour assurer l'euthanasie, vérifier sous le microscope pour l'arrêt des battements du cœur. Optionnel:Si l'expérience est non terminal, retirez le poisson soigneusement de l'agarose avec une pince fine et une brosse. Placer le poisson dans l'eau d'oeuf frais et de lui permettre de récupérer en observation pendant 15 min. Si le comportement de nage normale retourne, retournez le poisson dans l'incubateur. Evacuer les animaux transgéniques selon flux de déchets d'OGM approuvé de l'institution.