셀 리니지 마커의 공동 현지화와 토마토 신호
Summary
면역과 (조골 세포에 특정) 2.3Col1a1-GFP 하나 하나 (뼈 세포에 특정) : 우리는 두 / Cre 호텔이 마우스를 (특히 연골 세포에서 발현) (보편적으로 모든 세포에서 발현) Rosa26의 tdtomato의 조합을 추적 세트를 개발했다. 데이터는 골 연골 세포로의 직접적인 변환을 보여준다.
Abstract
셀 혈통 추적 시스템이 발달 생물학 연구에서 주로 사용되어왔다. Cre 호텔 재조합 효소의 사용은 특정 세포주 모든 자손의 리포터의 활성을 허용한다. 여기, 우리가 연골 세포를 직접 긴 뼈와 Cre 호텔, Col10a1-Cre 호텔과 Aggrecan-Cre 호텔 ERT2 (AGG-Cre 호텔 ERT2) 두 종류를 사용하여 하악 외과 개발 과정에서 조골 세포와 골 세포로 변형을 입증하는 기술을 추적 세포 혈통을 사용 Rosa26 교차 tdTomato. Col10과 aggrecan 모두 연골 세포에 대한 마커를 잘 인식하고 있습니다.
이를 바탕으로, 우리는 특정 세포 마커의 발현을 면역 형광 분석하여 정의 간 세포 운명과 함께 추적하는 새로운 방법 세포 계보를 개발했다. Runx2 (초기 단계의 조골 세포에 대한 마커) 및 상아질 매트릭스 protein1 (DMP1; 말기 조골 세포 마커) 있었다연골 유래 뼈 세포 및 분화 상태를 식별하는 데 사용된다. 이 조합은 셀의 혈통 추적의 적용을 넓혀, 또한 화합물 마우스의 생성을 간소화 아닙니다. 더 중요한 것은, 부모 세포 자손의 수, 위치 및 분화 상태는 단독으로 추적 세포 혈통보다 더 많은 정보를 제공하는 동시에 표시됩니다. 결론적으로, 셀 혈통 추적 기술과 면역의 공동 응용 프로그램은 생체 내에서 세포 생물학을 조사하기위한 강력한 도구입니다.
Introduction
개발하는 동안, 연골 내 골 형성의 골격 체적의 80 % 이상을 차지한다. 널리은 비대 연골 세포의 사멸로 시작하는 것으로 생각된다. 그 후, 기본 골수의 세포 침입과 뼈 marrow- 및 골막 유래 세포 1,2에 의해 새로운 뼈 증착 다음에 혈관 신생을 시작합니다. 비대 연골 세포 운명 HCS ()는, 그러나, 수십 년 3 논쟁의 문제였다. 초기의 HC는 연골 세포 분화 경로의 종료로 간주하고, 일반적으로 아폽토시스의 HC의 궁극적 운명 것으로 생각되었다. 지금, 일부 연구자들은 적어도 일부의 HC가 살아남을 수 및 연골 뼈 형성에 기여하는 것이 좋습니다. 그들이 그 성장을 제안했지만 판 연골 세포는 미세 구조, 면역 조직 화학 염색을 기반으로 조골 세포에 transdifferentiate 수있는 능력을 가지고 있었고, 시험 관내에서, 46이 방법 w 전혀 연구되지조골 세포 계보에 연골 세포의 기여를 입증에 결정적인 감수해야.
셀 혈통 추적 기술은 세포의 운명을 연구하는보다 엄격한 방법을 제공합니다. 간단히 말하자면, 오직 셀의 특정 유형에서 발현되는 재조합 효소, 리포터 유전자의 발현을 자극한다. 이러한 방식으로,이 세포의 종류와 그 후손 영구적 7로 표시된다. Cre 호텔-에 loxP 시스템은 일반적으로 혈통 추적에 사용됩니다. CRE (재조합 효소 효소) 둘에 loxP 부위 사이 STOP 서열을 절제하고 특정 세포주 (도 1a)에서 리포터를 활성화한다. 일부의 경우, 연구자는 에스트로겐 수용체 (Cre 호텔 ERT2) (8)의 수정 된 형태로 융합 Cre 호텔을 일으키는 등 타목시펜과 같은 약물을 사용하여 Cre 호텔을 활성화 유리한 시점을 선택할 수 있습니다. 형광 기자는 극적으로 복잡성을 줄일 수 있기 때문에 실험을 추적 혈통의 표준이되었다및 8,9 추적 세포 운명의 정확성과 효율성을 향상시킨다. 그것은 쉽게 7 (도 1A)를 시각화하게 밝은 형광 단백질과 강한 표면 형광을 갖기 때문에 tdTomato 형광 리포터 중에서 최상의 선택되고있다.
시스템을 추적 Rosa26 tdTomato 계보를 사용하여, 우리 그룹과 다른 연구자의 HC 개발 10-14 동안 뼈 세포로 자신의 표현형을 변경할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 2.3Col1a1-GFP (조골 세포에 특정)과 면역 (뼈 세포에 특정) :이 작업을 수행하기 위해, 우리는 Rosa26의 tdtomato (유비쿼터스 식 모든 셀에서) / Cre 호텔 (연골 세포에 특정) 마우스와 조합을 추적하는 두 세트를 개발했다. 데이터는 두 가지 방법이 생체 내에서 세포의 운명을 연구하는 가능한 방법이라는 것을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기술적 한계로 인해, 생체 내에서 세포의 거동을 조사하는 것이 어렵다. 그러나, 셀 혈통 추적 기술은 세포 생물학 7-9을 연구하기위한 강력한 도구로 증명된다. 본 연구에서는 상기 면역과 조합하여 프로토콜을 향상시킨다. 이러한 방식으로, 세포 운명 리니지 추적의 적용을 넓혀 연관된 여러 마커에 의해 정의 될 수있다. 또한, 면역, 토마토 신호의이 공동 현지화 동시에 단독으로 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
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