We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
Skjelettet er et svært intrikat, dynamisk og komplekst organ som har en rekke funksjoner som spenner fra bevegelse, til ion homeostase. Består av bein og brusk, skjelettet består av funksjonelt forskjellige cellepopulasjoner som virker til å opprettholde det strukturelle, biokjemiske og mekanisk integritet 1. En av de primære funksjonene til skjelettet er dens rolle i utvikling og vekst. Disse prosessene krever orkestrering av flere cellepopulasjoner som er regulert gjennom tett endokrine og genetisk kontroll.
Med unntak av den flate bein f.eks scapula, kraniet og sternum, er pattedyr skjelettet er dannet gjennom prosessen som kalles endochondral forbening. Denne fremgangsmåten, reguleres både molekylært og romlig begynner med kondensasjon av mesenchymale celler avledet hovedsakelig fra mesoderm 2. Under påvirkning av transkripsjonsfaktoren SOX9, celler i the interiøret av condensations differensiere i chondrocytes, uttrykke og sekresjon brusk spesifikke ekstracellulære matrix (ECM) komponenter som type II kollagen og aggrecan. Celler i margen av kondens, uttrykke type I kollagen og danner perikondrium, opptegning av potensielle bein tre. Senere osteoprogenitors av perikondrium differensiere i osteoblaster, regissert av uttrykket av transkripsjonsfaktorer, Runx2 og osterix 4. Dette fører til en overvekt av osteoblaster, og dette sjiktet blir omdøpt periosteum som danner en mineralisert benete krage rundt midtpartiet av benet. Vaskulær gjennomtrengning av periosteum og invasjonen av brusk stillas skjer bringer med seg, haematopoetically avledet bein resorberende celler, osteoklaster, som resorbere de kondrocytt rester og mye av bruskmatrise-5. Mellomrommene dannes er fylt av osteoprogenitors gir opphav til den primære ossificationsenter som stadig opptar kjernen av diaphysis og fusjonerer med periosteum. Andre celler som gir opphav til benmargen. Rundt fødsel, blodårer og osteoprogenitors trenge inn i brusken rik matriks på hver side (epiphysis) av det fremkallende diaphysis for å danne den sekundære ossifikasjon sentrum. Beliggende mellom epifysen og diaphysis i hver ende av den lange bein er et band av brusk – epiphyseal vekst plate – som er ansvarlig for å koordinere lineær vekst av alle lange bein 6.
Chondrocytes innenfor veksten plate utgangspunktet sprer og deretter komme seg gjennom morfologisk forskjellige soner, koordinert av sekvensiell uttrykk for transkripsjons og vekstfaktorer. Kulminasjonen av dette hendelsesforløpet er avkjøringen fra cellesyklusen og hypertrofi av chondrocytes i sentrum for denne brusk forløper. Hypertrofiske chondrocytes sterkt uttrykke typen X kollagen og matriksmetalloproteinase-13 (MMP13) og deres betydelig volum utvidelse i retning av lengdevekst gir det største bidraget til bein vekst hos pattedyr 7,8. Videre hypertrofisk kondrocytter mineralize deres omkringliggende ECM gjennom frigjøring av matrise vesikler, membran avgrenset struktur spesialisert for fremstilling av amorft kalsiumfosfat gjennom deres inkludering av fosfataser (vev ikke-spesifikk alkalisk fosfatase (TNAP) og PHOSPHO1) og kalsiumkanalproteiner (annexins ) 9-11. Dette forkalket brusk er invadert av blodårer fra den underliggende marg resulterer i osteoclast rekruttering og matrise resorpsjon. Dette blir etterfulgt av osteoblastmigrering og innretting til overflaten av forkalkede brusk restene hvor de legge ned et lag av osteoid som er hurtig mineralisert. Det vevde ben av primær spongiosa er senere ombygd til lamellær bein av den sekundære spongiosa 12. Epiphyseal fusion resultater iopphør av endochondral ossifikasjon 13.
Endochondral ossifikasjon er under streng regulering av mange endokrine og parakrine hormoner og vekstfaktorer, slik som å forhindre forstyrret utvikling og / eller langsgående benvekst 14. En bedre forståelse av molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn disse prosessene er derfor viktig i vårt arbeid for kliniske fremskritt mot menneske fordel. Tidligere forskning på likheter og forskjeller mellom vekstplater i ulike aldre, steder og arter har mye bedre vår forståelse av de fysiologiske mekanismene rundt veksten plate dynamikk 15,16. Imidlertid er studiet av isolerte kondrocytter vanskelig, da fjerning av kondrocytter fra omgivelsene kan føre til dedifferentiation, ledsaget av tap av ekspresjon av viktige markører som for eksempel Col2a1 17.
Musen metatarsal organ eksplantering kultur, pioneered av professor Elisabeth Burger og kolleger i Nederland, er en svært fysiologisk ex vivo modell for å studere endochondral forbening og bein vekst som veksten av bein i kultur ligner det man ser i vivo 18. Unikt, tillater metatarsal-organkultur-undersøkelsen av kondrocytter i ulike faser av chondrogenesis og vedlikeholder celle-celle og celle-matriks interaksjoner, derfor gir betingelser nærmere til in vivo situasjonen enn celler i kultur 19-21. Videre tillater denne modellen for direkte undersøkelse av lineær benvekst som ikke er mulig i primærkulturer kondrocytt. Det tillater også for separasjon av systemiske og lokale faktorer derfor tillater den spesifikke analyse av de lokale effekter på vekstplaten.
Kulturen i metatarsal tillater undersøkelse av tallrike parametre. Daglige målinger av total lengde og av de mineraliserte regionenerudimenter kan utføres med standard fasekontrastmikroskopi og bildeanalyse programvare. Histologiske, in situ hybridisering og immunhistokjemi flekker kan lett utføres på metatarsal seksjoner, som gjør det mulig for den romlige oppløsningen av både cellulære og molekylære enheter, en stor fordel fremfor tradisjonelle cellekulturmetoder. Immunhistokjemisk tilnærming inkluderer påvisning og kvantifisering av 5-brom-2'-deoxyuridine (BrdU) opptak av voksende chondrocytes 22. I tillegg kan ytterligere behandling av metatarsal vev bli utført for å tillate for genetisk analyse av mRNA-ekspresjon (RT-qPCR), protein og intracellulær signalisering analyse (Western blotting) eller lipid sammensetning (massespektrometri). De fleste studier til dato bruk kultur embryonale metatarsals fremfor metatarsals fra post-natal dyr. Mens begge modellene kan være informative, studiet av embryonale bein har flere fordeler: de vokser raskere og kan være exploset til å studere initiering og progresjon av mineraliseringsprosessen 23-25.
Denne protokollen beskriver i detalj den intrikate disseksjon av embryonale metatarsals fra bakbenet av embryonale dag 15 (E15) museembryoer. Videre er vekst og mineralisering av anatomisk distinkte metatarsals vist.
Kulturen i murine embryonale metatarsals gir en svært fysiologiske modell av endochondral vekst og mineralisering. Tidlige studier har bekreftet at E15 mus metatarsals gjennomgå et normalt mønster av skjelettvekst og differensiering. Brusk (chondrocytes) og bein (osteoblaster og osteoklaster) celler og deres respektive kollagen matriser er umulig å skille fra de som ble observert in vivo. Det er imidlertid anerkjent noen begrensninger av denne modell. Hastigheten på osteoclast differensiering er svekket som er bein vekst (men ikke brusk differensiering). Benvekst er ca 50% langsommere enn det som er observert in vivo, og kan være på grunn av mangler i systemiske faktorer som påvirker produksjonen av lokale faktorer (for eksempel IGF-1, BMP, etc.) 31. Dessuten er det velkjent at benet er følsom for den mekaniske miljø, og dette er også tilfelle for dyrkede metatarsals, som svarer til cHanges i mekanisk belastning 32,33. Derfor, i ubelastede situasjoner, slik det er beskrevet i denne protokollen, mineralisering og mineral resorbsjon kan være kompromittert. Ikke desto mindre byr metatarsal modellen evnen til å direkte måle lineær benvekst som ikke er mulig via 2D og 3D in vitro kultursystemer.
Vi har gitt en omfattende beskrivelse av protokollen involvert i disseksjon og kultur av E15 murine metatarsals og faktisk, for første gang, bekrefter gyldigheten av sammenslåing de to nd, 3. og 4. metatarsal for eksperimenter.
Metatarsals fra E17 / E18 blir ofte brukt for å undersøke mekanismene for bein vekst på grunn av sin ekstraordinære potensial til å vokse ex vivo for lange perioder av gangen (dvs. utover 14 dager i kultur). De er en veletablert modell for å undersøke rollene til vekstfaktorer på embryonale langsgående bein vekst.I tillegg er disseksjon og kulturen i postnatal metatarsal som vanligvis anvendes for å avgrense de mekanismene som omgir postnatal benvekst som det er underforstått at postnatal benvekst og fosterets benvekst er regulert på en annen måte 21. Den beinvekst observert i dyrkede postnatal metatarsals er imidlertid betydelig mindre enn det som ble observert i embryonale barnelærdom 25,34, noe som begrenser deres potensial i langtidsstudier og fremhever mer systemisk påvirkning på beinvekst på dette postnatal stadiet. Faktisk 3 dager gamle postnatale metatarsals fra mus er vanligvis den siste tilgjengelige som kan anvendes for å oppnå målbar vekst 34.
Her beskriver vi vår protokoll for isolering av embryoniske metatarsal bein på E15. Fraværet av hydroxyapaptite mineral i E15 metatarsal ben betyr at de gir en uovertruffen modell for å undersøke ikke bare de mekanismene som omgir langsgående bein vekst, men også initieringenav skjelettmineralisering. Den mineraliserte matrise av terminalen hypertrofisk chondrocyttransplantasjon sonen gir et stillas for å invadere osteoblaster å legge ned et bein bestemt matrise (osteoid) som deretter blir mineralisert, og som sådan denne innledende mineralisering er avgjørende for vellykket og funksjonell beindannelse 35. Faktisk en rekke nylige rapporter som benytter E15 metatarsals har bekreftet sin unike evne til etterforskningen av mineraliseringsprosessen 28,36,37. I tillegg har forskere beskrev bruken av E15 metatarsal som en modell av angiogenese 38, fremhever potensialet i embryonale metatarsal som modell utenfor benvekst / mineralisering innstilling.
Protokollen vi beskriver bare krever standard laboratorieutstyr inkludert en laminær hette, en dissekere mikroskop for å utføre disseksjon, og en CO 2 inkubator for kulturen i utskårende barnelærdom. Videre er en meget grunnleggende culture medium inneholdende aMEM, BSA, antibiotika, antimykotika og L-askorbinsyre (et ko-faktor i syntesen av hydroksyprolin og hydroksylysin, to essensielle aminosyrer for produksjonen av kollagen 39) unngår bruk av udefinerte additiver, for eksempel dyr sera . Tradisjonelt har forskere lagt βGP til mediet som brukes til kultur embryoniske metatarsals men som åpenbart i våre resultater, ikke er nødvendig å bruke en ytterligere fosfatkilde for vellykket mineralisering i dette kultursystem. Dette er et viktig funn i vår streben etter å forstå mekanismene som ligger til grunn ECM mineralisering.
Metatarsals har tidligere blitt infisert med adenovirus som inneholder dominante negative former av Smad2 for å undersøke hvilken rolle transformerende vekstfaktor β i reguleringen av lange ben utvikling 40. Her finner vi også avsløre vellykket transfeksjon av vill type E15 metatarsal bein med GFP viruspartikler, noe som indikerer that lentiviral teknikker kan lett bli vedtatt å manipulere genekspresjon i metatarsal kulturer. Tilsvarende metatarsal-organkultur-system er en utmerket modell der for å sammenligne veksten av bein fra genetisk forandret mus for bedre å forstå rollen til et bestemt gen i benet vekstprosessen. Våre tidligere undersøkelser har anvendt metatarsal-organkultur-system for å bestemme rollen til suppressor cytokin signale-2 (SOCS2) i endochondral benvekst. Ved hjelp av metatarsal bein fra mus som mangler SOCS2, har vi vist at veksthormon er i stand til å simulere deres lengdevekst uavhengig av insulinlignende vekstfaktor (IGF-1), i motsetning til vill-type metatarsal ben som ikke responderer på veksthormon behandling 34, 41. Dette understreker i hvilken grad metatarsal kulturer kan bli manipulert til å undersøke effekten av ulike gener og / eller eksogene faktorer på endochondral bein vekst.
Oppsummert har vi detailedes en fremgangsmåte for vellykket utvinning og kultur av embryoniske metatarsal bein som kan manipuleres og undersøkt ved anvendelse av en rekke analyser. Denne eks vivo modellen opprett celle-celle og celle-matriks-vekselvirkninger, så vel som inneholder kondrocytter i ulike faser av chondrogenesis, derfor gir en mer fysiologisk modell enn celler i monolag eller 3D-kultur. Metatarsal orgel kulturer er derfor en unik modell for å undersøke de molekylære mekanismene som er ansvarlig for endochondral ossifikasjon, og er viktig for å videreutvikle vår forståelse av både bein fysiologi og patofysiologi
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |