We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
कंकाल एक अत्यधिक जटिल गतिशील और जटिल अंग है, हरकत से फैले कार्यों की एक सीमा है कि आयन homeostasis है। हड्डी और उपास्थि के शामिल थे, कंकाल कार्यात्मक अलग सेल आबादी जो यह संरचनात्मक जैव रासायनिक और यांत्रिक अखंडता 1 है बनाए रखने के लिए संचालित होते हैं। कंकाल के प्राथमिक कार्यों में से एक विकास और विकास में अपनी भूमिका है। इन प्रक्रियाओं जो तंग अंत: स्रावी और आनुवंशिक नियंत्रण के माध्यम से नियंत्रित कर रहे हैं कई सेलुलर आबादी के आर्केस्ट्रा की आवश्यकता होती है।
फ्लैट हड्डियों जैसे कंधे की हड्डी, कपाल और उरोस्थि के अपवाद के साथ, स्तनधारी कंकाल endochondral हड्डी बन जाना रूप में जाना जाता प्रक्रिया के माध्यम से ही बना है। इस प्रक्रिया को विनियमित दोनों molecularly और स्थानिक, mesoderm 2 से मुख्य रूप से ली गई mesenchymal कोशिकाओं का संक्षेपण के साथ शुरू होता है। प्रतिलेखन कारक SOX9 के प्रभाव के तहत, वीं में कोशिकाओंcondensations की ई आंतरिक chondrocytes में अंतर, व्यक्त करने और इस तरह के रूप में प्रकार द्वितीय कोलेजन और aggrecan उपास्थि विशिष्ट बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों स्रावित। संघनन के मार्जिन, पर कोशिकाओं प्रकार मैं कोलेजन और perichondrium फार्म एक्सप्रेस, भावी हड्डी 3 वर्णन। बाद में, perichondrium की osteoprogenitors अस्थिकोरक में अंतर, प्रतिलेखन कारक, Runx2 और osterix 4 की अभिव्यक्ति द्वारा निर्देशित। यह अस्थिकोरक की एक विशेषता की ओर जाता है और इस परत periosteum जो हड्डी के मध्य वर्ग के चारों ओर एक mineralized बोनी कॉलर रूपों नाम बदला है। Periosteum और उपास्थि पाड़ के आक्रमण के संवहनी प्रवेश, इसके साथ लाने होता haematopoetically हड्डी resorbing कोशिकाओं, अस्थिशोषकों, जो उपास्थिकोशिका अवशेष और उपास्थि मैट्रिक्स 5 के ज्यादा resorb निकाली गई। रिक्त स्थान का गठन प्राथमिक हड्डी बन जाना को जन्म दे रही osteoprogenitors से भर रहे हैंकेंद्र जो उत्तरोत्तर diaphysis की कोर रह रहे हैं और periosteum के साथ विलीन हो जाती है। अन्य कोशिकाओं अस्थि मज्जा को जन्म दे। जन्म के आसपास, रक्त वाहिकाओं और osteoprogenitors माध्यमिक हड्डी बन जाना केंद्र के रूप में विकसित करने के लिए diaphysis के दोनों तरफ (एपिफ़ीसिस) में उपास्थि अमीर मैट्रिक्स घुसना। अधिवर्धी विकास की थाली – – जो सभी लंबी हड्डियों 6 के रैखिक विकास समन्वय के लिए जिम्मेदार है लंबी हड्डियों के दोनों छोर पर एपिफ़ीसिस और diaphysis के बीच स्थित कार्टिलेज के एक बैंड है।
विकास की थाली के भीतर Chondrocytes शुरू में पैदा करना और बाद में आकृति विज्ञान के अलग-अलग क्षेत्रों, प्रतिलेखन और वृद्धि कारकों के अनुक्रमिक अभिव्यक्ति द्वारा समन्वित के माध्यम से प्रगति। घटनाओं के इस अनुक्रम की परिणति यह उपास्थि अग्रदूत के केंद्र में सेल चक्र और chondrocytes की अतिवृद्धि से बाहर निकलने के लिए है। हाइपरट्रॉफिक chondrocytes दृढ़ता से अभिव्यक्त प्रकार एक्स कोलेजन और मैट्रिक्स metalloproteinase-13 (MMP13) और अनुदैर्ध्य विकास की दिशा में उनकी काफी मात्रा बढ़ने स्तनधारियों 7.8 में हड्डियों के विकास के लिए सबसे बड़ा योगदान है। इसके अलावा, hypertrophic chondrocytes मैट्रिक्स पुटिकाओं की विज्ञप्ति के माध्यम से अपने आसपास ईसीएम धातु के, झिल्ली घिरा संरचनाओं उनके () ऊतक गैर विशिष्ट क्षारीय फॉस्फेट (TNAP और PHOSPHO1) फास्फेटेजों के शामिल किए जाने और कैल्शियम channeling प्रोटीन (annexins के माध्यम से अनाकार कैल्शियम फॉस्फेट के उत्पादन के लिए विशेष ) 9-11। इस calcified उपास्थि अस्थिशोषक भर्ती और मैट्रिक्स अवशोषण में जिसके परिणामस्वरूप अंतर्निहित मज्जा से रक्त वाहिकाओं द्वारा हमला किया है। यह अस्थिकोरक प्रवास और संरेखण द्वारा calcified उपास्थि अवशेष की सतह जहां वे osteoid की एक परत है जो तेजी से mineralized है नीचे रखना करने के लिए पीछा किया जाता है। प्राथमिक spongiosa का बुना हड्डी बाद में माध्यमिक spongiosa 12 की परतदार हड्डी के लिए remodeled है। में अधिवर्धी संलयन परिणामendochondral हड्डी बन जाना 13 की समाप्ति।
Endochondral हड्डी बन जाना के रूप में इतनी परेशान विकास और / या अनुदैर्ध्य हड्डियों के विकास को रोकने के लिए 14 कई अंत: स्रावी और पैराक्राइन हार्मोन और विकास कारकों से तंग विनियमन के अधीन है। इन प्रक्रियाओं को मजबूती आणविक और सेलुलर तंत्र का एक बेहतर समझ इसलिए मानव लाभ की दिशा में नैदानिक अग्रिमों के हमारे प्रयास में जरूरी है। समानता और अलग अलग उम्र, स्थानों और प्रजातियों के विकास के प्लेटों के बीच मतभेद में पिछले अनुसंधान में काफी विकास की थाली गतिशीलता 15,16 आसपास के शारीरिक तंत्र के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है। हालांकि, अलग-थलग chondrocytes के अध्ययन के रूप में अपने वातावरण से chondrocytes को हटाने, dedifferentiation करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं इस तरह के Col2a1 17 के रूप में महत्वपूर्ण मार्करों की अभिव्यक्ति के नुकसान के साथ, मुश्किल है।
माउस प्रपदिकीय अंग explant संस्कृति, पीआईनीदरलैंड में प्रो एलिजाबेथ बर्गर और उनके सहयोगियों द्वारा oneered, हड्डियों संस्कृति में नकल है कि इन विवो 18 में देखा की विकास दर के रूप में endochondral हड्डी बन जाना और हड्डियों के विकास के अध्ययन के लिए एक अत्यधिक शारीरिक पूर्व vivo मॉडल है। विशिष्ट, प्रपदिकीय अंग संस्कृति इसलिए संस्कृति 19-21 में कोशिकाओं की तुलना में vivo स्थिति के करीब की स्थिति प्रदान उपास्थिजनन के विभिन्न चरणों में chondrocytes की परीक्षा की अनुमति देता है और सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत को बनाए रखता है। इसके अलावा, इस मॉडल रैखिक हड्डियों के विकास का प्रत्यक्ष परीक्षा जो प्राथमिक उपास्थिकोशिका संस्कृतियों में संभव नहीं है के लिए अनुमति देता है। यह भी प्रणालीगत और स्थानीय कारकों इसलिए विकास की थाली पर स्थानीय प्रभाव के विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति के अलग होने के लिए अनुमति देता है।
metatarsals की संस्कृति कई मापदंडों की जांच के लिए अनुमति देता है। कुल लंबाई और mineralized क्षेत्रों के दैनिक मापआरंभ मानक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है। ऊतकीय, सीटू संकरण और immunohistological धुंधला में आसानी से प्रपदिकीय वर्गों, जो दोनों सेलुलर और आणविक संस्थाओं, पारंपरिक सेल संस्कृति तरीकों पर एक बड़ा लाभ के स्थानिक संकल्प के लिए अनुमति देता है पर प्रदर्शन किया जा सकता है। प्रतिरक्षाऊतकरसायन दृष्टिकोण का पता लगाने और के 5 ब्रोमो 2'- deoxyuridine (BrdU) तेज मात्रा का ठहराव chondrocytes 22 proliferating द्वारा भी शामिल है। इसके अतिरिक्त, प्रपदिकीय ऊतकों की आगे की प्रक्रिया mRNA अभिव्यक्ति (आरटी-qPCR), प्रोटीन और intracellular संकेतन विश्लेषण (पश्चिमी सोख्ता) या लिपिड रचना (मास स्पेक्ट्रोमेट्री) के बहाव के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए किया जा सकता है। तिथि करने के लिए सबसे अध्ययन प्रसवोत्तर जानवरों से metatarsals बजाय सुसंस्कृत भ्रूण metatarsals का उपयोग करें। नदीम दोनों मॉडलों जानकारीपूर्ण किया जा सकता, भ्रूण हड्डियों के अध्ययन के कई फायदे हैं: वे तेजी से आगे बढ़ने और विस्फोटक हो सकता हैited दीक्षा और खनिज प्रक्रिया 23-25 की प्रगति का अध्ययन करने के लिए।
इस प्रोटोकॉल भ्रूण दिन 15 (E15) murine भ्रूण की हिंद अंग से भ्रूण metatarsals के जटिल विच्छेदन विस्तार से वर्णन है। इसके अलावा, विकास और संरचनात्मक रूप से अलग metatarsals की खनिज दिखाया गया है।
murine भ्रूण metatarsals की संस्कृति endochondral विकास और खनिज की एक अत्यधिक शारीरिक मॉडल उपलब्ध कराता है। प्रारंभिक अध्ययन पुष्टि की है कि E15 माउस metatarsals कंकाल विकास और भेदभाव के एक सामान्य पैटर्न से गुजरना। उपास्थि (chondrocytes) और हड्डी (अस्थिकोरक और अस्थिशोषकों) कोशिकाओं और उनके संबंधित श्लेषजनउत्पादी matrices विवो में मनाया उन लोगों से पृथक कर रहे हैं। हालांकि, इस मॉडल के कुछ मान्यता प्राप्त सीमाएं हैं। अस्थिशोषक भेदभाव की गति हड्डियों के विकास के रूप में है (लेकिन भेदभाव उपास्थि नहीं) बिगड़ा हुआ है। हड्डियों के विकास के लिए लगभग 50% विवो में मनाया कि तुलना में धीमी है और प्रणालीगत कारक हैं जो स्थानीय कारकों (जैसे, IGF-1, BMPs, आदि), 31 के उत्पादन को प्रभावित करने में कमियों की वजह से हो सकता है। इसके अलावा, यह अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है कि हड्डी अपने यांत्रिक पर्यावरण के प्रति संवेदनशील है और यह भी सुसंस्कृत metatarsals, जो सी का जवाब के लिए मामला हैयांत्रिक लोड हो रहा 32,33 में hanges। इसलिए, उतार स्थितियों में, के रूप में इस प्रोटोकॉल, खनिज में वर्णित है और खनिज अवशोषण समझौता किया जा सकता है। फिर भी, प्रपदिकीय मॉडल सीधे रैखिक हड्डी विकास जो इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में 2 डी और 3 डी के माध्यम से संभव नहीं है उपाय करने की क्षमता प्रदान करता है।
हम विच्छेदन और E15 murine metatarsals और वास्तव में की संस्कृति में शामिल पहली बार के लिए प्रोटोकॉल के लिए एक व्यापक विवरण प्रदान की है, प्रयोगों के लिए 2 एन डी, 3 और 4 वें metatarsals पूलिंग की वैधता की पुष्टि करें।
E17 / E18 से Metatarsals सामान्यतः (संस्कृति में 14 दिनों से परे यानी) समय की लंबी अवधि के लिए पूर्व vivo विकसित करने के लिए उनकी असाधारण क्षमता के कारण हड्डियों के विकास के तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। वे भ्रूण अनुदैर्ध्य हड्डियों के विकास पर विकास के कारकों की भूमिका की जांच करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल हैं।इसके अतिरिक्त, विच्छेदन और प्रसव के बाद metatarsals की संस्कृति सामान्यतः के रूप में यह समझा जाता है कि प्रसव के बाद हड्डियों के विकास और भ्रूण हड्डियों के विकास को अलग ढंग से 21 विनियमित रहे हैं प्रसव के बाद हड्डी विकास आसपास के तंत्र को चित्रित करने के लिए कार्यरत है। हड्डियों के विकास सुसंस्कृत प्रसव के बाद metatarsals में मनाया हालांकि भ्रूण आरंभ 25,34 में मनाया तुलना में काफी कम है, लंबी अवधि के अध्ययन में अपनी क्षमता सीमित है और इस चरण में प्रसव के बाद हड्डियों के विकास पर अधिक प्रणालीगत प्रभाव पर प्रकाश डाला। दरअसल, चूहों से 3 दिन पुराने प्रसव के बाद आम तौर पर metatarsals नवीनतम चरण है कि औसत दर्जे का विकास 34 प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
यहाँ हम E15 पर भ्रूण प्रपदिकीय हड्डियों के अलगाव के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन है। E15 प्रपदिकीय हड्डियों में खनिज hydroxyapaptite की अनुपस्थिति का मतलब है कि वे न केवल अनुदैर्ध्य हड्डी विकास आसपास के तंत्र की जांच करने के लिए एक बेजोड़ मॉडल, लेकिन यह भी दीक्षा प्रदान करते हैंकंकाल खनिज की। टर्मिनल hypertrophic उपास्थिकोशिका क्षेत्र के mineralized मैट्रिक्स अस्थिकोरक हमलावर एक हड्डी विशिष्ट मैट्रिक्स (osteoid) जो बाद में mineralized है नीचे रखना करने के लिए एक पाड़ प्रदान करता है, और इस तरह इस प्रारंभिक खनिज के रूप में सफल और कार्यात्मक हड्डी गठन 35 के लिए महत्वपूर्ण है। दरअसल E15 metatarsals उपयोग हाल की रिपोर्ट के एक नंबर खनिज प्रक्रिया 28,36,37 की जांच के लिए उनके अद्वितीय क्षमता की पुष्टि की है। इसके अलावा, शोधकर्ताओं angiogenesis 38 की एक मॉडल के रूप में E15 metatarsals के उपयोग का वर्णन किया है, हड्डियों के विकास / खनिज की स्थापना के बाहर मॉडल के रूप में भ्रूण metatarsals की क्षमता पर प्रकाश डाला।
प्रोटोकॉल का वर्णन हम एक लामिना का प्रवाह हुड, विच्छेदन के प्रदर्शन के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप, और excised आरंभ की संस्कृति के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर सहित केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है। इसके अलावा, एक बहुत ही बुनियादी संस्कृतिमध्यम αMEM, बीएसए, एंटीबायोटिक दवाओं, antimycotics और एल-एस्कॉर्बिक एसिड युक्त संरचना (hydroxyproline और hydroxylysine के संश्लेषण में एक सह-कारक, कोलेजन 39 के उत्पादन के लिए दो आवश्यक अमीनो एसिड) इस तरह के जानवर सीरा के रूप में अपरिभाषित योजक, के उपयोग से बचा जाता है । परंपरागत रूप से, जांचकर्ताओं संस्कृति भ्रूण metatarsals करने के लिए इस्तेमाल करने के लिए मीडिया βGP जोड़ लिया है लेकिन जैसा कि हमारे परिणाम में पता चला, एक अतिरिक्त स्रोत फॉस्फेट का उपयोग इस संस्कृति प्रणाली में सफल खनिज के लिए आवश्यक नहीं है। यह तंत्र ईसीएम खनिज underpinning समझने के हमारे प्रयास में एक महत्वपूर्ण खोज है।
Metatarsals पहले Smad2 के प्रमुख नकारात्मक रूपों युक्त लंबी हड्डी विकास 40 के नियमन में वृद्धि कारक β बदलने की भूमिका का पता लगाने के लिए adenoviruses से संक्रमित किया गया है। यहाँ हम भी GFP वायरस कणों के साथ जंगली प्रकार E15 प्रपदिकीय हड्डियों के सफल अभिकर्मक पता चलता है, टी का संकेतटोपी lentiviral तकनीक आसानी से प्रपदिकीय संस्कृतियों में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए अपनाया जा सकता है। इसी तरह, प्रपदिकीय अंग संस्कृति प्रणाली है जिसमें आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों से हड्डियों के विकास की तुलना करने के लिए बेहतर हड्डियों के विकास की प्रक्रिया में एक विशेष जीन की भूमिका को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। हमारे पिछले अध्ययनों endochondral हड्डियों के विकास में साइटोकाइन का शमन संकेत -2 (SOCS2) की भूमिका निर्धारित करने के लिए प्रपदिकीय अंग संस्कृति प्रणाली का उपयोग किया है। SOCS2 में चूहों की कमी से प्रपदिकीय हड्डियों का उपयोग करना, हम चाहते हैं कि वृद्धि हार्मोन है पता चला है वृद्धि कारक जैसे इंसुलिन के अपने अनुदैर्ध्य विकास स्वतंत्र अनुकरण करने में सक्षम (आईजीएफ -1), जंगली प्रकार प्रपदिकीय हड्डियों जो वृद्धि हार्मोन उपचार 34 का जवाब नहीं है के विपरीत, 41। यह किस हद तक प्रपदिकीय संस्कृतियों अलग जीन और / या endochondral हड्डियों के विकास पर बहिर्जात कारकों के प्रभाव की जांच करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है पर प्रकाश डाला गया।
सारांश में, हम Detai हैसफल निकासी और भ्रूण प्रपदिकीय हड्डियों जो चालाकी से किया जा सकता है की संस्कृति के लिए एक विधि का नेतृत्व किया और विश्लेषण की एक किस्म का उपयोग कर जांच की। इस पूर्व vivo मॉडल इसलिए monolayer या 3 डी संस्कृति में कोशिकाओं की तुलना में एक अधिक शारीरिक मॉडल उपलब्ध कराने, सेल सेल और सेल मैट्रिक्स बातचीत का कहना है के रूप में अच्छी तरह से उपास्थिजनन के विभिन्न चरणों में chondrocytes शामिल हैं। Metatarsal अंग संस्कृतियों इसलिए endochondral हड्डी बन जाना लिए जिम्मेदार आणविक तंत्र की जांच के लिए एक अनूठा मॉडल हैं, और दोनों हड्डी शरीर विज्ञान और pathophysiology के बारे में हमारी समझ को आगे के लिए आवश्यक हैं
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |