Une étude comparative des médicaments Méthodes de livraison ciblés à l'oreille de la souris intérieure: Bullostomy<em> Versus</em> Transtympaniques Injection

Veiller à ce que les procédures de manipulation des animaux sont conformes aux réglementations nationales et internationales. Le protocole fait suite à la RD Communauté européenne 2010/63 / UE et espagnol 53/2013 lignes directrices, respectivement. Manipulation 1. Généralités animaux Souris Feed ad libitum avec un régime standard et de l' eau potable. la santé de contrôle et de bien-être en suivant Fédération des animaux de laboratoire Associations Science (FELASA) __gVirt_NP_NNS_NNPS<__ recommandations. Évaluation 2. Audition NOTE: Track impact fonctionnel des procédures de microchirurgie en testant audience avant et plusieurs fois après la chirurgie (dans ce travail 2, 7, 14 et 28 d postmicrosurgery) avec les procédures non-invasives telles que ABR 9. Pour les tests ABR, anesthésier les souris avec des protocoles d'effet de courte durée à savoir l' injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg / kg de poids corporel (BW) et de xylazine (10mg / kg, BW). Vous pouvez également effectuer des tests d'audition sous anesthésie inhalant. NOTE: Puisque les paramètres ABR peuvent être influencés par le protocole anesthésique 28, utiliser le même pendant toute l'expérience. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie en testant le réflexe toe-pincement. REMARQUE: Lorsque le réflexe de retrait disparaît, l'animal a atteint une profondeur appropriée de l'anesthésie pour effectuer des tests auditifs. Protéger les yeux de la dessiccation et la kératoconjonctivite sèche secondaire par l' administration topique de suppléments lacrymaux, tels que des gels à base de méthylcellulose-hydroxypropyle. Gardez la souris à la température physiologique (37,5-38 ° C) pendant toute la procédure. Pour éviter des interférences électriques, utilisez un tapis de pompe à eau et de chauffage chauds. Surveiller la température du corps avec des sondes rectales. Il faut toujours prendre soin de ne pas surchauffer l'animal. NOTE: Nous vous recommandons de nettoyer le coussin chauffant avec un désinfectant de surface entre les souris.0; Pour l'induction d'anesthésie et de récupération, coussins chauffants électriques, lampes à incandescence ou infrarouges peuvent être utilisées. procédure ABR NOTE: Pour l'enregistrement ABR, utilisez un poste de travail d'ordinateur avec une carte son intérieur pour créer des formes d'onde (numérique à analogique, sortie DA, conversion) et de numériser des formes d'onde de réponse électrique (analogique à, entrée AD numérique), un atténuateur, un oscilloscope et un un amplificateur à faible impédance. Postes de travail auditives modernes (c. -à- Tucker Davis Techonologies) comprennent tous ces composants dans un système compact unique. Placer la souris anesthésiées en position couchée sur les plots de chauffage à l' intérieur d' une chambre d'atténuation acoustique pour éviter les interférences de bruit ambiant et de la réverbération (figure 1). Fournir des stimuli acoustiques dans le conduit auditif externe. Utilisez stimuli préréglés ou de nouveaux signaux conçus avec le logiciel approprié. Connectez la sortie du poste de travail DA à l'enceinte sélectionnée. NOTE: Frehaut-parleurs e-champ ou champ fermé insérées dans le canal auditif externe pourraient être utilisés. Les premiers sont préférés lorsque l'on travaille avec des souris en raison de la difficulté d'insertion de la sonde et de l'étalonnage sonore dans des systèmes fermés. haut-parleurs de champ libre stimulent les deux oreilles et provoquent une réponse binaural. Pour obtenir des réponses principalement monophoniques avec haut – parleurs de champ libre, l' activité controlatéral doit être éliminé par l' occlusion (ie avec des bouchons d'oreille) ou en masquant le bruit. Placez champ libre haut-parleur à une distance fixe (généralement 5-20 cm) face à la tête ou l'oreille sélectionnée avec le centre de l'enceinte aligné avec le conduit auditif externe. Veiller à ce qu'aucun obstacle se situent entre le haut-parleur et l'oreille et que le pavillon est complètement ouvert. Placer des électrodes en acier inoxydable d'aiguilles hypodermiques comme suit: i) l'électrode active (positif) dans le cuir chevelu entre les oreilles (sur le sommet du crâne), ii) la référence (négative) de l'électrode, dans la parotiderégion sous le pavillon, et iii) l'électrode de masse dans la région du membre arrière, la queue ou arrière (Figure 1). Vérifier l'impédance électrique dans les électrodes positives et négatives. Assurez-vous que l'impédance est inférieure à 3 kOhm (idéalement 1 kOhm). Si elle est supérieure, repositionner, propre avec de l'alcool ou de remplacer les électrodes. Pour l' enregistrement ABR, générer des clics à large bande et les fréquences de sons purs et présents à la diminution des intensités 90-10 dB par rapport au niveau de pression acoustique (SPL) en 5-10 dB SPL étapes 27, 29, 30. Bref clic ou ton Présent éclatèrent stimuli (1-5 ms) en commençant par de haut niveau (soit 80 ou 90 dB SPL) et de réduire l'intensité de 5-10 dB , SPL. Inscrivez la réponse électrique dans les 10 premières ms après la stimulation (évoqués réponses ABR apparaissent à 6-8 ms). NOTE: Pour cette raison, les taux de stimulationne devrait pas être supérieure à 50 stimuli / s (taux normal 20-50). Amplifier, record et la moyenne de la réponse électrique évoquée à chaque stimulus et de l'intensité. Utilisez un amplificateur à faible bruit et un bon rapport signal-bruit, et le connecter à l'entrée AD. NOTE: ABRs ont de très faibles amplitudes, typiquement inférieure à 1 mV (crête à crête) et doivent être enregistrés en utilisant un amplificateur à très faible bruit. Chez les souris auditives normales, les vagues ABR claires émergent après une moyenne de 100 – 200 réponses, mais pour obtenir des enregistrements de haute qualité, ou dans le cas de la déficience auditive, plus de répétitions sont recommandées (750-1,000) 27. Visuellement déterminer le seuil ABR pendant le test. REMARQUE: Le seuil ABR est la plus faible intensité des stimuli sonores qui déclenche une ABR fiable d' enregistrement avec des vagues I à IV tension 2 SD clairement visible et moyenne crête à crête au- dessus de l'activité de fond moyenne 31. Ces données doivent être confirmées dusonner une analyse hors-ligne, ainsi que d'autres paramètres, y compris la latence de pointe et interpeak, et des vagues amplitudes. Effectuer l'analyse des données manuellement ou automatiquement. Pour une analyse manuelle, identifier les 4-5 ondes ABR (I, II, III … etc.) Et marquer les sommets (P1, P2, P3 …) et les vallées (N1, N2, N3 …) pour chaque vague. Une fois l'analyse terminée, les données d'exportation vers un tableur ou un fichier texte. REMARQUE: Un logiciel spécifique pour l'enregistrement de réponse électrique effectue habituellement l'analyse automatiquement. Des mesures supplémentaires peuvent être déterminées dans l'enregistrement ABR en réponse à une intensité fixe (soit 70 ou 80 dB SPL) ou à des intensités relatives au clic individuels seuils (soit 15 dB SPL – dessus du seuil). Effectuer une analyse statistique des données ABR en utilisant le logiciel approprié. Selon la conception expérimentale, utilisation standard jumelé T-test ou d'analyse de la variance (ANOVA) pour comparer principale Paramé ABRtres dans les différents groupes 26, 30. NOTE: Dans les études longitudinales, de nombreuses données fonctionnelles sont collectées à partir du même animal à différents points temporels (avant et après microchirurgie). Dans ce cas, un modèle répété linéaire mesure test général fournit une analyse détaillée des écarts. 3. Préparation du véhicule Préparer et utiliser des solutions de véhicules dans des conditions stériles. NOTE: Les solutions liquides sont généralement effacés rapidement par la trompe d'Eustache. Différents systèmes d'administration injectables peuvent être utilisés pour augmenter le temps de séjour du médicament dans l'oreille moyenne, y compris des hydrogels et des nanoparticules 32. Pour préparer CGP-hydrogel, dissoudre 75% chitosane désacétylé dans 0,2 M d'acide acétique donne un 1,5-2% (poids / poids) solution de chitosane. Ajouter 9% glycérophosphate (poids / poids) à cette solution 7. Préparer la solutionjuste avant l'administration et à stocker l'hydrogel à 4 ° C jusqu'à utilisation. NOTE: Le CGP-hydrogel est modérément visqueuse mais toujours injectable à cette température. En dessous de 4 ° C, il se transforme en une phase solide, en bloquant son application. Après l'application, le CGP subit une transition de phase en un gel semi-solide à environ 15 min à 37 ° C. Aliquote (0,5 ml) tampon RL commerciale et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation. 4. Procédures de microchirurgie Provoquer anesthésie générale avec la kétamine à base de combinaisons de sédatifs et analgésiques (ie kétamine 100 mg / kg, medetomidine 0,05 mg / kg et phentanile 0,025 mg / kg) par injection intrapéritonéale, suivie par des agents inhalés (c. -à -isoflurane). Après l' administration d' agents injectables, ajuster le masque anesthésique au museau de la souris et branchez l'O 2 alimentation à la vapeur d' isoflurane. Maintenir l'anesthésie par inhalation au cours de lamicrochirurgie et surveiller le plan anesthésique avec le réflexe toe-pincement et de la respiration. Commencer la préparation chirurgicale lorsque le réflexe est totalement aboli et la souris présente une respiration régulière. Maintenir la température du corps avec les coussins chauffants pendant toute la procédure et à protéger les yeux contre kératite avec un gel à base de méthylcellulose hydroxypropyle. Préparer une zone chirurgicale propre en utilisant des champs stériles. Stériliser les instruments de microchirurgie à un stérilisant de billes de verre avant la chirurgie. Maintenir des conditions stériles pendant la procédure chirurgicale entière (gants stériles, des rideaux, des instruments chirurgicaux, etc.). microchirurgie Bullostomy NOTE: Bullostomy est une procédure unilatérale. Faire fonctionner une oreille de la souris et utiliser l'oreille controlatérale comme témoin. Placez la souris dans une position couchée décubitus. Préparer la zone chirurgicale à la surface ventrale du cou à l'aide d'une tondeuseretirer la fourrure. Nettoyer la peau avec une solution antiseptique à base d'iode povidone, et le couvrir avec des champs stériles. L'utilisation d'un scalpel, faire une incision longitudinale de 2 cm de la mandibule à la clavicule. Sous un grossissement avec un microscope chirurgical, identifier les glandes sous-maxillaires et séparer les deux avec une pince. Rentrez les glandes sous-maxillaires et de localiser l'origine du muscle digastrique et le nerf facial. Faire une incision dans l'origine du muscle digastrique avec une paire de ciseaux, et rétracter ventral, exposant la face inférieure médiale sous – jacente de la bulle tympanique. Faire une ouverture dans la bulle en perçant avec une aiguille 27 G (figure 2A). Localisez l'artère stapédienne et la RW membrane caudale à elle (figure 2B). Nettoyer le sang à partir de la zone percée avec une éponge de gélatine absorbable. L'utilisation d'un cathéter G 34 et un micro en verre seringue, injecter lentement 3-5 μL de solution de véhicule (CGP-hydrogel ou RL) par l'intermédiaire bullostomy directement sur le créneau RW, de le remplir (figure 2C). Sceller le bullostomy avec 1-2 gouttes de colle tissulaire. Remettre les glandes sous-maxillaires dans leur position initiale et fermer les incisions de la peau avec 5-0 soie suture chirurgicale. Appliquer un antiseptique autour de l'incision pour éviter l'infection de la plaie à base de chlorhexidine. REMARQUE: Les sutures absorbables et non absorbables peuvent être utilisés. des sutures non absorbables doivent être éliminés en 2 semaines. La soie est pas recommandé pour la fermeture de la peau puisque son utilisation est associée à une infection de l'incision et les réactions tissulaires locales. injection transtympaniques bilatérale Placer la souris dans la position de décubitus latéral et préparer un champ opératoire aseptique en dessous du conduit auditif externe , comme décrit dans 4.3.1.1. Faire incision a 0,5 cm longitudinale dans la partie verticale du conduit auditif externe à proximité du tragus et section du pli cutané interne du pavillon (en option). Localisez la membrane tympanique à l'extrémité du canal de l' oreille externe à l' aide d' un microscope chirurgical (Figure 2F) et identifier les pars supérieurs flaccida et la pars inférieurs TENSA, qui est divisé en sections antérieures et postérieures par le manche du marteau (figure 2F) . Faire un petit myringostomy dans la partie caudale de la pars flaccida. Faire une incision supplémentaire dans la tensa pars de la membrane tympanique, pour permettre l' évacuation de l' air lors de l' injection 33. Injecter doucement 10-15 pi de véhicule (CGP-hydrogel ou RL) solution avec un micro en verre seringue reliée à un G cathéter 34 à travers la pars flaccida, à proximité de la niche RW jusqu'à ce que l'oreille moyenne est clairement plein. Fermer les incisions de la peau avec une suture chirurgicale 5-0 en soie et propre comme décrit dans 4.3.1.7. Placer la souris sur son autre côté, et opermangé l'oreille controlatérale (étapes 4.3.2.1 à 4.3.2.5). Gardez la souris sur un coussin chauffant jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. Surveiller l'état du corps, l'activité et la présence de signes de douleur ou de stress. Fournir des analgésiques , si nécessaire ( par exemple la buprénorphine à 0,05 mg / kg, carprofène 5-10 mg / kg). Examiner la plaie chirurgicale quotidienne et enlever la fermeture de la peau 7-14 jours après l'opération après avoir vérifié que la blessure est guérie. 5. Morphologique Évaluation de Cochlear cytoarchitecture Euthanasier la souris à la fin de l'expérience (dans ce travail 28 jours postmicrosurgery), avec une overdose de pentobarbital intrapéritonéale (100 mg / kg) pour étudier les effets à long terme de la chirurgie. Effectuer une perfusion transcardial de froid 0,1 M tamponnée au phosphateSalin (PBS), pH 7,5, suivi de 4% (poids / volume) de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS 0,1 M, pH 7,5 , comme décrit 26. ATTENTION: Le paraformaldéhyde est très toxique; éviter tout contact avec la peau, les yeux ou les muqueuses. Éviter de respirer la poudre lors de la mesure et de la préparation. Utiliser un microscope stéréoscopique pour disséquer l'oreille interne de l'os temporal , comme décrit 34, 35 sans séparer le vestibulaires et les composants de la cochlée de l'oreille interne. Fixer l'oreille interne isolée avec 4% (en poids / v) PFA dans 0,1 M PBS, pH 7,5 à 4 ° C pendant 12 h avec agitation douce. Lavage 3x pendant 5 min avec du PBS 0,1 M, pH 7,5. Détartrer les échantillons avec de l'acide éthylènediaminetétraacétique 10% (EDTA), préparé dans du PBS 0,1 M, pH 6,5 à 4 ° C pendant 10 jours avec une agitation constante, en changeant la solution d'EDTA tous les 3 jours. Lorsque cochleae acquérir une consistance molle, enlever EDTA et laver 3x pendant 5 min avec 0,1 M de PBS, pH 7,5, wie agitation à RT. Incluez les échantillons dans la cire de paraffine comme décrit 34 et font 7 um sections cochléaires épaisses parallèles au modiolus. Pour évaluer cytoarchitecture cochléaire, sections de tache avec l' hématoxyline et l' éosine (H & E) 30 et utiliser un microscope optique relié à un appareil photo numérique pour capturer des images avec 4X et 20X lentilles. 6. Cochlear Gene Expression Nettoyer la surface de travail et des instruments chirurgicaux avec une solution de décontamination RNAse. Euthanasier la souris comme décrit dans 5.1 et disséquer l'oreille interne de l'os temporal en utilisant un microscope rapidement. Immerger l'oreille interne dans un plat en verre contenant de l'acide ribonucléique (ARN) protecteur et réactif stabilisant. Retirer l'os pétreux restante avec une pince de bijoutier et séparer délicatement la cochlée du vestibule en utilisant les yeux ciseaux de Vanna 35. Immédiatement transfer la cochlée dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml avec 80 ul d'ARN protecteur et stabilisant solution et congeler le tissu en plaçant le tube dans la glace sèche. Conserver les échantillons cochléaires à -70 ° C jusqu'à utilisation. Isoler ARN cochléaire comme décrit 35 et de déterminer sa qualité et la quantité spectrophotométrie. Générer ADNc cochléaire à partir de quantités égales d'ARN total de la souris en utilisant une transcription inverse kit commercial. Effectuer qRT-PCR pour amplifier l' acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc) en triple pour mesurer la transcription de gènes 35, 36. NOTE: Dans ce pro- travail et les transcriptions des Il1b, IL6, TGFb1, TNFa, IL10 et DUSP1 gènes anti-inflammatoires ont été mesurés. Calculer les taux d'expression relatifs en normalisant seuil de cycle de transcription cible (CT) au niveau de la moyenne arithmétique du niveau du gène de référence et la quantification relative en normalisantgroupe problème des niveaux de transcription à la moyenne arithmétique du groupe calibrateur 37.