Immunocoloration des articles biocytine remplis et transformés pour neurochimiques Marqueurs

Le cerveau est connue pour la diversité dans les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de ses éléments neuronaux individuels. Comprendre les rôles des types de neurones distincts dans le fonctionnement du cerveau et de la pathologie nécessite la caractérisation et l'identification sans ambiguïté des neurones. Structurellement, les caractéristiques morphologiques définies par emplacement somato-dendritique déterminent les entrées potentielles qu'un neurone donné reçoit, tandis que le modèle d'arborisation axonale identifie des cibles postsynaptiques potentiels. La diversité structurelle des neurones a été apprécié depuis les journées d'études histologiques séminales de Ramón y Cajal ^1. L'avènement des techniques d'enregistrement monocellulaires ont révélé que les neurones structurellement distincts présentent également des différences dans les schémas de mise à feu et des caractéristiques synaptiques. La diversité dans la structure et la physiologie est particulièrement évidente dans GABAergiques neurones inhibiteurs ^2,3. En outre, il est devenu de plus en plus évident que structurally neurones similaires peuvent exprimer différents marqueurs neurochimiques et montrent des différences fonctionnelles ⁴ correspondantes. De même, les neurones avec les mêmes marqueurs neurochimiques peuvent avoir des structures et des fonctions ^5-10 distinctes. Ainsi, en pratique, l'analyse des caractéristiques fonctionnelles des neurones et leur rôle dans le réseau implique de définir les deux identités morphologiques et neurochimiques. Même avec l'arrivée des lignées de souris rapporteurs de ciblage de marqueurs neurochimiques spécifiques, il est souvent nécessaire de déterminer la morphologie et l' identité des sous – types sur la base de ¹¹ immunohistologie.

La méthode standard utilisée pour caractériser les cellules enregistrées dans des tranches de cerveau aiguë est de les remplir avec biocytin ou neurobiotin lors de l'enregistrement, de fixer les sections de paraformaldehyde (PFA) après les enregistrements, et utiliser l'immunohistochimie pour révéler la morphologie et la neurochimie. Comme l'épaisseur des sections pour la tranche de la physiologie sont généralement 300 umou plus, et parce que la plupart des anticorps ne parviennent pas à pénétrer tout au long de cette profondeur, les tranches doivent être re-coupe de 60 um ou moins pour permettre immunocoloration simultanée biocytine et des marqueurs neurochimiques ^12-14. Malheureusement, la résection est laborieuse; les risques de perte de tissu pendant la coupe; et peut conduire à une différence de retrait des tissus, ce qui complique les reconstitutions morphologiques. En outre, la connaissance préalable de la morphologie pourrait aider à réduire les marqueurs candidats qui sont susceptibles d'être exprimé par les cellules. Nous avons modifié les protocoles de immunohistologiques biocytin standards pour permettre le traitement de série de premières sections pour la récupération de la morphologie et ensuite pour l'identification de marqueurs neurochimiques potentiels.

L' immunohistochimie est l'étude de la distribution des antigènes dans des tissus ou cellules et peut être visualisé en utilisant une enzyme, des marqueurs fluorescents, les éléments radioactifs, ou des particules colloïdales d'or ^15. La procédure impl quent l'utilisation d'anticorps primaires pour marquer spécifiquement et amplifier un ou plusieurs antigènes spécifiques, suivie par l'utilisation d'anticorps secondaires fluorescents de ciblage de l'anticorps primaire pour la visualisation. En raison de la nécessité de distinguer les spectres de fluorescence de chaque anticorps secondaire sans chevauchement, seul un nombre limité d'antigènes peut être examinée simultanément. Ainsi, la connaissance préalable de la morphologie pourrait être utile dans le choix des candidats marqueurs neurochimiques pour la classification des cellules. Conceptuellement, la raison d'un traitement en série des sections déjà colorées est basé sur la prémisse que immunomarquage pour une protéine ou un peptide ne doit pas interférer avec antigénicité et immunomarquage subséquente pour un peptide structurellement indépendante ^16. Cette absence d'interférence est due à la liaison des anticorps à un épitope de la protéine spécifique d'un antigène et permet la coloration simultanée des antigènes multiples dans le même tissu par conséquent. Le nombre d'antigènes Revealed par immunocoloration est limitée par la nécessité pour les spectres de non-chevauchement des anticorps secondaires fluorescents et par la nécessité de cibler des antigènes individuels avec des anticorps dirigés dans différentes espèces de façon à éliminer la réactivité croisée ^17,18. Bien que ce soit le raisonnement derrière l'étiquetage série plutôt que simultanée avec deux anticorps différents qui peuvent interagir, à notre connaissance, immunocoloration pour un second antigène n'a pas été signalée après l'achèvement de immunomarquage pour un ou plusieurs antigènes sur des tronçons montés. Ici, nous décrivons une méthode pour immunocoloration série de sections précédemment colorées et montées. Alors que nous détaillons ce processus pour une procédure de immunomarquage série pour la récupération de la morphologie suivie d'une coloration des marqueurs de protéine / peptide dans des sections épaisses, les mêmes procédures peuvent être utilisées dans la norme, des sections minces histologiques ainsi. En outre, nous décrivons une approche pratique pour remplir les neurones enregistrés avec biocytin et le processus pour déloger lal' électrode de la cellule lors de l' achèvement des enregistrements afin d' optimiser le remplissage du axonale et arborisation dendritique des neurones, tels que présentés dans notre récent travail de ^6,8.

L'avantage le plus important de la procédure décrite ici est que la morphologie de la cellule enregistrée peut être entièrement récupérée et imagée avant de tenter de résection ou immunocoloration des tranches. Bien que des problèmes avec la pénétration de certains anticorps peuvent rendre nécessaire de tranches de résection pour immunocoloration secondaire, les procédures détaillées ici éliminerait la nécessité de reconstruire les neurones complexes à partir de plusieurs sections et éviterait les problèmes dus à la perte de tissus et de retrait différentiel, ce qui peut compromettre la reconstruction suivant la résection. Un avantage supplémentaire est que le processus permettra de réduire le coût, le temps, l'effort, et des anticorps coûteux en limitant immunocoloration et re-sectionnant à des tranches dans lequel les neurones biocytin remplis sont récupérés. L'aspect le plus pratique est l'annonceimmunocoloration tradi- qui peut être effectuée sur des coupes colorées mois avant d'utiliser la technique mentionnée ci-dessus. En particulier, la récupération de la morphologie réduirait considérablement le risque que les données physiologiques à partir des cellules sont rejetées en raison d'une incapacité à obtenir une caractérisation morphologique de base du type de cellule.